氟對大鼠成骨細(xì)胞Nrf2-ARE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 本研究利用原代培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞，研究氟對成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激，DNA損傷，細(xì)胞增殖與凋亡， HO-1和NQO1的基因表達(dá)及Nrf2基因表達(dá)和其蛋白含量的影響，探討Nrf2-ARE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在氟致成骨細(xì)胞損害中的作用。
　　 方 法：
　　 1實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.1成骨細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
　　 初生（1～2d）SPF級(jí)的SD大鼠購自廣東省廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。無菌條件下分

2、離大鼠顱蓋骨進(jìn)行成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液(含15％FBS，200∪/ml雙抗)，5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到80％～90％融合時(shí)，以1:2進(jìn)行傳代。培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、NBT/BCIP法染色鑒定，并繪制細(xì)胞的生長曲線。
　　 1.2 成骨細(xì)胞形態(tài)觀察及細(xì)胞增殖測定
　　 將成骨細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，觀察氟對成骨細(xì)胞形態(tài)的影響并攝片；將相同數(shù)量的成骨細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24h后，

3、按NaF終濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00mmol/L進(jìn)行染毒，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h，用MTT法檢測細(xì)胞的增殖能力。
　　 1.3細(xì)胞周期和凋亡率的檢測
　　 將細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)24h后染氟24h、48h和72h，分別收集12000個(gè)細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀在激發(fā)光波長Ex=488nm，發(fā)射光波長Em=530nm下分析PI熒光的直方圖。采用美國PHEONIX公司的MULTYCYCLE軟件進(jìn)行

4、細(xì)胞周期的分析，采用WINMDI軟件進(jìn)行細(xì)胞凋亡率的分析。
　　 1.4 成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激水平測定
　　 將細(xì)胞接種于24孔板培養(yǎng)24h后染氟24h、48h和72h，收集所得細(xì)胞懸液，采用亞硝酸鹽法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用二硫雙硝基苯甲酸（DTNB）法測定谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性、采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的含量。
　　 1.5 成骨細(xì)胞DNA損

5、傷的測定
　　 用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)（SCGE）檢測成骨細(xì)胞DNA的拖尾及損傷情況：制備瓊脂載玻片，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并攝片，用SCGE圖像分析系統(tǒng)IMI1.0逐個(gè)分析細(xì)胞；用酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的含量：細(xì)胞接種及染毒24h、48h和72h后，收集所得細(xì)胞，使用8-羥基脫氧鳥苷檢測試劑盒和酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)8-OHdG的含量。
　　 1.6 RNA提取和

6、RT-PCR實(shí)驗(yàn)
　　 將細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿，實(shí)驗(yàn)分為：單純?nèi)痉M，tBHQ預(yù)處理組。用Trizol試劑盒提取成骨細(xì)胞的總RNA，用PrimeScriptTM RT-PCR Kit試劑盒檢測單純?nèi)痉M和tBHQ預(yù)處理組成骨細(xì)胞內(nèi)HO-1mRNA和NQO1mRNA及核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 mRNA的表達(dá)。
　　 1.7免疫蛋白印跡（western blotting）實(shí)驗(yàn)
　　 將細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿，實(shí)驗(yàn)分為

7、：單純?nèi)痉M，tBHQ預(yù)處理組。用
　　 NucbusterTM Protein Extraction Kit試劑盒提取核蛋白和漿蛋白，BCA蛋白試劑盒對蛋白含量定量，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上（250mA，80min）。用5％脫脂牛奶對PVDF膜進(jìn)行孵育，用一抗Nrf2（1:300）和內(nèi)參?-actin（1:500），二抗兩者都為1:2000濃度雜交，按照ECL發(fā)光試劑盒操作步驟進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，

8、并對其進(jìn)行曝光顯像，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白灰度值分析，結(jié)果用實(shí)驗(yàn)組與對照組的平均灰度值的相對值表示。
　　 2 統(tǒng)計(jì)分析
　　 各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。滿足正態(tài)性分布且方差齊的兩組之間差異的比較用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組之間差異的比較用單因素的方差分析，組間兩兩比較用SNK檢驗(yàn)法，數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性檢驗(yàn)時(shí)用非參數(shù)檢驗(yàn)，顯著性水平ɑ=0.05，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義。
　　 結(jié) 果：
　　 1細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定
　　 剛分離的細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察呈微小透亮的圓球形，折光性強(qiáng)，細(xì)胞貼壁后主要呈短梭形、細(xì)長梭形、三角形及不規(guī)則形。細(xì)胞經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和NBT/BCIP法染色鑒定為成骨細(xì)胞。
　　
　　 2 氟對成骨細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞增殖活性的影響
　　 對照組可見細(xì)胞已匯合成致密單層，重疊生長、聚集成團(tuán)的增殖狀態(tài)，低劑量組細(xì)胞數(shù)量有所減少，并出現(xiàn)少量空泡的細(xì)

10、胞，高劑量組可見細(xì)胞數(shù)目明顯減少、細(xì)胞間隙增大、空泡增多。隨著染氟濃度的增加和染氟時(shí)間的延長，成骨細(xì)胞的增殖活性均受到抑制，細(xì)胞的存活率呈下降趨勢（P<0.05）。
　　 3 氟對成骨細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡的影響
　　 氟對成骨細(xì)胞周期的影響主要表現(xiàn)為促使G0/G1期細(xì)胞增多，S期及G2/M期細(xì)胞減少；0.25，0.50，1.00，2.00mmol/L劑量組細(xì)胞凋亡不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.00mmol/L劑量組氟對細(xì)胞

11、凋亡的誘導(dǎo)作用顯著，凋亡率明顯升高（P<0.05）。
　　 4 氟對成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響
　　 染氟24h和48h段，與對照組比較，隨著染氟濃度的增加成骨細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶SOD和GSH-Px活性存在下降的趨勢，但72h段，SOD活性先下降后升高；而各時(shí)段高劑量組脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量則較對照組明顯升高（P<0.05）。
　　 5 氟對成骨細(xì)胞DNA損傷的影響
　　 染氟24h，成骨細(xì)胞DNA損

12、傷不明顯，染氟48h、72h后，各劑量組的細(xì)胞DNA尾長、Olive尾距、尾DNA％及尾/頭長比與對照組相比增加，并隨著濃度的增加而逐漸升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但當(dāng)4.00mmol/L劑量組時(shí)，上述指標(biāo)較之前劑量有所降低。細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG的含量隨著染氟濃度的增加呈升高的趨勢（P<0.05）。
　　 6 氟對成骨細(xì)胞Nrf2 mRNA表達(dá)及蛋白含量的影響
　　 單純?nèi)痉M：隨著染毒濃度

13、的增加，在24h和48h段NaF能夠持續(xù)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 mRNA的表達(dá)，但隨著染毒時(shí)間延長至72h，這種誘導(dǎo)作用變的不明顯；細(xì)胞染毒24h、48h后NaF能夠持續(xù)使細(xì)胞漿中Nrf2蛋白含量下降，而細(xì)胞染毒48h后NaF能夠持續(xù)使細(xì)胞核中Nrf2蛋白含量升高。
　　 tBHQ預(yù)處理組：tBHQ預(yù)處理12h后再加氟處理24h、48h和72h，Nrf2 mRNA的表達(dá)反較單純?nèi)痉M下降，在24h段核蛋白中Nrf2蛋白

14、含量較同組單純?nèi)痉M升高。
　　 7 氟對成骨細(xì)胞HO-1及NQO1mRNA表達(dá)的影響
　　 單純?nèi)痉M：單純?nèi)痉?4h和72h，大鼠成骨細(xì)胞內(nèi)HO-1及NQO1mRNA表達(dá)未觀察到明顯變化；單染氟48h，0.25mmol/L組細(xì)胞內(nèi)HO-1及NQO1mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)；0.50、2.00和4.00mmol/L組細(xì)胞內(nèi)HO-1mRNA表達(dá)較對照組明顯下降(P<0.05)，而4.00mmol/L組細(xì)胞內(nèi)N

15、QO1mRNA表達(dá)顯著升高。
　　 tBHQ預(yù)處理組：24h和72h段HO-1mRNA表達(dá)較單純?nèi)痉M下降；在48h段，4.00mmol/L組能夠誘導(dǎo)HO-1mRNA表達(dá)升高；24h 段4.00mmol/L組細(xì)胞內(nèi)NQO1mRNA表達(dá)較同組的單純?nèi)痉M下降；48h段，0.25 mmol/L組NQO1mRNA表達(dá)較同組的單純?nèi)痉M下降；72h段，0.50、2.00、4.00mmol/L組NQO1mRNA表達(dá)較同組的單純?nèi)痉M下降(

16、P<0.05)。
　　 結(jié) 論：
　　 1氟能抑制成骨細(xì)胞增殖，改變細(xì)胞周期，但只有高劑量（4.00mmol/L）時(shí)成骨細(xì)胞才發(fā)生顯著凋亡。
　　 2 氟可致大鼠成骨細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化并造成DNA 損傷，同時(shí)也能降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性。
　　 3 氟可誘導(dǎo)大鼠成骨細(xì)胞Nrf2基因的表達(dá)和蛋白含量的增加，進(jìn)而使Nrf2-ARE下游靶基因HO-1和NQO1表達(dá)增加，使細(xì)胞的抗氧化能力增強(qiáng)。
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