Cbp分子在CD59 GPI介導(dǎo)的T細(xì)胞抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用研究.pdf

1、目的:研究GPI錨固蛋白CD59與Cbp在細(xì)胞上的定位及在T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的相互作用，以探討CD59向T細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)的相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，通過(guò)激光共聚焦熒光顯微鏡系統(tǒng)對(duì)CD59、Cbp的定位進(jìn)行了分析。利用RNA干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)Cbp基因的寡核苷酸序列，克隆至線性化的pSUPER載體中構(gòu)建pSUPER-siCbp重組質(zhì)粒并進(jìn)行鑒定。采用電轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察GFP基因表達(dá)

2、，并行RT-PCR和western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Cbp的表達(dá)。將pSUPER-siCbp、pEGFP-N3-Cbp、突變型pEGFP-N3-Cbp三種質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增并酶切鑒定，同樣轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組Cbp蛋白的表達(dá)。CD59mAb交聯(lián)刺激細(xì)胞后，western blot檢測(cè)各組Csk、p-ZAP-70和p-Fyn表達(dá)量;MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖;ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中白介素2（IL-2）的水平。
　　 結(jié)果:

3、激光共聚焦結(jié)果顯示:細(xì)胞靜止時(shí)，Cbp分子點(diǎn)狀聚集于膜上，CD59分子廣泛分布;隨著細(xì)胞活化，Cbp少量的散在分布，而CD59表達(dá)增多并點(diǎn)狀聚集。pSUPER-siCbp重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR、DNA PCR、限制性內(nèi)切酶雙酶切分析和DNA測(cè)序鑒定正確。各轉(zhuǎn)染組可表達(dá)綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染J2-pSUPER-siCbp重組質(zhì)粒的Jurkat細(xì)胞中Cbp基因表達(dá)量明顯低下其他各組。選取J2組質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)結(jié)果:與未轉(zhuǎn)染組比較，在基因與蛋白水平

4、，干擾組Cbp表達(dá)減少，而高表達(dá)組和突變組Cbp表達(dá)增加。CD59mAb交聯(lián)刺激細(xì)胞后，與未轉(zhuǎn)染組比較，干擾組和突變組細(xì)胞增殖快，IL-2分泌增多，Csk、p-ZAP-70和p-Fyn增多，突變組變化更明顯;高表達(dá)組細(xì)胞則與之相反。
　　 結(jié)論:CD59可借助棕櫚?；鶊F(tuán)使Cbp分子磷酸化，向細(xì)胞內(nèi)傳遞抑制信號(hào)，引起細(xì)胞內(nèi)相關(guān)分子的一系列變化，為探討CD59與Cbp在T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相互作用及CD59 GPI胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制奠