信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在癲癇發(fā)病中作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一邵分無鎂誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元癲癇模型的建立 目的 研究體外原代培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)元的方法，觀察神經(jīng)元的純度、生長特性和生存狀態(tài)，并觀察在無鎂培養(yǎng)液短暫作用后神經(jīng)元產(chǎn)生癲癇樣放電的情況，以建立一種海馬神經(jīng)元的癲癇模型，為進(jìn)一步探討癲癇的發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)。 結(jié)論：體外原代低密度離散培養(yǎng)新生24h大鼠海馬神經(jīng)元操作簡單、可行；采用差速貼壁法和加用神經(jīng)生長因子可獲得純度較高、生存狀態(tài)良好的神經(jīng)元；體外培養(yǎng)4天后

2、神經(jīng)元相互之間形成廣泛的突觸聯(lián)系，培養(yǎng)前2周神經(jīng)元生長旺盛，4周后神經(jīng)元逐漸變性死亡。采用無鎂細(xì)胞外液誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元3h即可產(chǎn)生穩(wěn)定的癲癇樣放電，持續(xù)至96h后仍呈現(xiàn)穩(wěn)定的、自發(fā)的、反復(fù)的癲癇樣放電。無鎂誘導(dǎo)的體外原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元癲癇模型無明顯的神經(jīng)元壞死發(fā)生，僅96h后始有顯著意義的凋亡發(fā)生，可見該細(xì)胞模型穩(wěn)定性、可靠性良好，可用于進(jìn)一步研究癲癇的發(fā)病機(jī)制。第二部分縫隙連接通路在癲癇發(fā)病中作用機(jī)制的研究

3、目的 研究縫隙連接(GJ)蛋白(Cx)Cx32和Cx43在癇性放電后海馬神經(jīng)元的表達(dá)，以及GJ解偶聯(lián)劑一生胃酮(CBX)和抗癲癇藥卡馬西平(CBZ)對Cx32/43和癇性發(fā)作的干預(yù)作用，試圖探究GJ通路在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用。 結(jié)論：體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元在無鎂細(xì)胞外液誘導(dǎo)產(chǎn)生癇樣放電后，縫隙連接蛋白Cx32/43表達(dá)顯著增高，其中Cx32表達(dá)水平高于Cx43。加用GJ通路阻斷劑CBX顯著抑制了Cx32/43的表達(dá)，并同時(shí)

4、抑制神經(jīng)元的癲癇樣放電；PTZ致癇大鼠腦內(nèi)縫隙連接蛋白Cx32/43在大鼠出現(xiàn)驚厥發(fā)作后顯著增多，CBX同時(shí)抑制腦內(nèi)縫隙連接蛋白Cx32/43的表達(dá)和大鼠驚厥發(fā)作，提示縫隙連接偶聯(lián)在神經(jīng)元同步化活動(dòng)中加強(qiáng)，提供了癇性放電的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，GJ參與癲癇發(fā)病的病理生理機(jī)制，具有致癇作用。CBZ能夠抑制PTZ所致大鼠驚厥發(fā)作和無鎂液誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的癲癇樣放電，但不影響縫隙連接蛋白Cx32/413的表達(dá)，表明其抗癲癇作用機(jī)制與阻斷GJ無關(guān)。

5、可見在傳統(tǒng)的以化學(xué)性突觸、離子通道等為作用靶點(diǎn)的抗癲癇藥物外，開發(fā)作用于縫隙連接通道的治療藥物有可能為癲癇尤其是難治性癲癇的治療提供新的途徑。 第三部分 ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在癲癇發(fā)病中作用機(jī)制的研究 目的 研究細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶通路及其活化形式一磷酸化ERKl/2(p-ERKl/2)在癇樣發(fā)作后海馬神經(jīng)元的表達(dá)時(shí)程和規(guī)律，同時(shí)觀察絲裂原活化蛋白激酶通路抑制劑PD98059對發(fā)作以及ERK通路的影響，以探討ERK信號通

6、路在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用。 結(jié)論：體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元正常有少量ERKl/2表達(dá)，而p-ERKl/2兒乎不表達(dá)。無鎂液誘導(dǎo)神經(jīng)元出現(xiàn)癲癇樣放電后早期，p-ERKl/2表達(dá)增強(qiáng)，而ERKl/2表達(dá)無明顯增多。ERK通路阻斷劑PD98059顯著抑制了p-ERKl/2的表達(dá)，以及海馬神經(jīng)元自發(fā)的、反復(fù)的癲癇樣放電。正常大鼠海馬有少量ERKl/2表達(dá)，PTZ致癇后p-ERKl/2表達(dá)迅速升高，阻斷ERK通路同時(shí)抑制ERKl/2的活化和動(dòng)