茶樹GA合成途徑中若干相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、以茶樹1005品系為研究對(duì)象，應(yīng)用PCR、RACE技術(shù)及在線生物信息學(xué)分析軟件，首次克隆并分析了茶樹酯型兒茶素合成前體物質(zhì)之一GA的生物合成途徑中aroB、aroDE基因的全長cDNA序列。結(jié)合對(duì)茶樹1005品系不同葉位酯型兒茶素含量的測定結(jié)果，選擇葉位為處理因素，并根據(jù)得到的aroB、aroDE序列設(shè)計(jì)特異引物，應(yīng)用熒光定量技術(shù)測定了aroB與aroDE基因在茶樹1005品系不同葉位的表達(dá)差異。
　　1.茶樹1005品系不同葉位

2、酯型兒茶素含量
　　茶樹1005品系酯型兒茶素總量變化范圍為6.71％~22.49%，一葉最高，老葉最低，其含量隨葉位次序的增加而顯著減少，含量高低次序?yàn)椋阂蝗~>芽>二葉>三葉>四葉>五葉>六葉>老葉。EGCG含量，在同一葉位中極顯著高于其他3種酯型兒茶素單體，在不同葉位中的含量變化范圍為2.26%~13.09%，其含量亦基本隨葉位次序的增加而顯著減少。整體上，順式酯型兒茶素含量極顯著高于反式兒茶素。
　　2.茶樹aroB基

3、因的全長cDNA克隆及生物信息學(xué)分析
　　應(yīng)用RACE技術(shù)，從茶樹1005品系頂芽首次克隆獲得aroB基因的全長cDNA序列，命名為 Cs1005-aroB，NCBI GeneBank登錄號(hào)為 KM009084。Cs1005-aroB cDNA序列全長1509bp，其中ORF序列長1350bp，3’UTR序列長89bp，5’UTR序列長70bp。
　　Cs1005-aroB蛋白生物學(xué)信息經(jīng)在線軟件預(yù)測分析，顯示：Cs1005

4、-aroB蛋白為親水性非分泌蛋白，穩(wěn)定性高，保守性強(qiáng)，三維結(jié)構(gòu)與中華獼猴桃aroB基因高度相似，親緣關(guān)系與歐洲山毛櫸較近，具有DHQS特征結(jié)構(gòu)域。推測Cs1005-aroB蛋白在葉綠體中合成，與其結(jié)合起激活作用的金屬離子為Fe2+。
　　3.茶樹aroDE基因的全長cDNA克隆及生物信息學(xué)分析
　　應(yīng)用RACE技術(shù)，從茶樹1005品系頂芽克隆獲得3條aroDE基因的全長cDNA序列，分別命名為Cs1005-aroDE1、Cs

5、1005-aroDE2、Cs1005-aroDE3，NCBI GeneBank登錄號(hào)分別為KM009085、KM009086、KM009087?；駽s1005-aroDE1全長2118bp，編碼519個(gè)氨基酸；Cs1005-aroDE2全長1990bp，編碼532個(gè)氨基酸；Cs1005-aroDE3全長1957bp，編碼525個(gè)氨基酸。3條aroDE基因同源性為64.32%，共同相似區(qū)域分布不連續(xù)，所編碼的氨基酸序列同源性為65.36

6、%，共同相似區(qū)域分布亦不連續(xù)。
　　Cs1005-aroDE1、Cs1005-aroDE2與Cs1005-aroDE3三條蛋白序列的生物學(xué)信息經(jīng)在線軟件預(yù)測分析，顯示：三種蛋白均為親水性非分泌酸性蛋白，穩(wěn)定性高；雖序列結(jié)構(gòu)相似性不高，但三種蛋白的空間結(jié)構(gòu)高度相似，均與擬南芥aroDE基因高度相似；三種蛋白磷酸化位點(diǎn)均較多；三種蛋白各自保守性都較強(qiáng)，均具有 DHQase_I、Shikimate_dh_N及 NAD_bind_Shik

7、imate_DH功能域，且蛋白Cs1005-aroDE2多出一個(gè)莽草酸結(jié)合位點(diǎn)；Cs1005-aroDE1蛋白合成與發(fā)揮作用的場所最可能在細(xì)胞質(zhì)中，而Cs1005-aroDE2與Cs1005-aroDE3蛋白合成與發(fā)揮作用的場所最可能在線粒體中；三種蛋白均各自與葡萄相應(yīng)類型的aroDE蛋白親緣關(guān)系較近，但彼此間親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。
　　4.茶樹1005品系不同葉位aroB與aroDE基因的定量表達(dá)分析
　　應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)