桑樹(shù)氮代謝相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、氮素是植物生長(zhǎng)、發(fā)育的必要元素，是植物的生命元素。植物可吸收利用的主要氮源是銨態(tài)氮和硝態(tài)氮。為適應(yīng)外界不同氮素，植物進(jìn)化出銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)不同氮素進(jìn)行分類吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和氮代謝。我國(guó)蠶桑業(yè)的歷史悠久。為了提高桑樹(shù)的產(chǎn)量，桑樹(shù)需要合理施用氮肥。但是，過(guò)量氮肥的施用，不僅不能被桑樹(shù)吸收而造成浪費(fèi)，還會(huì)引起環(huán)境污染。從分子生物學(xué)角度研究桑樹(shù)氮代謝，為選育高效氮吸收的桑樹(shù)新品種提供理論依據(jù)，有利于提高桑樹(shù)對(duì)氮素的吸收效率，對(duì)桑樹(shù)遺傳育種工

2、作具有一定的理論意義。
　　本實(shí)驗(yàn)以魯桑育71-1苗為材料，根據(jù)各物種的同源性分析比對(duì)后設(shè)計(jì)特異性引物，結(jié)合 RT-PCR、RACE、軟件拼接等技術(shù)獲得這三個(gè)基因的包含完整開(kāi)放閱讀框的cDNA序列，并對(duì)其序列進(jìn)行一系列生物信息學(xué)分析。運(yùn)用不同氮素誘導(dǎo)處理與熒光定量PCR對(duì)克隆出的三個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)分析。
　　主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.桑樹(shù)高親和銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AMT1基因的克隆、序列分析及表達(dá)分析
　　從魯桑育71-1

3、品種克隆得到包含完整開(kāi)放閱讀框的MmAMT1基因，其序列長(zhǎng)度即為1518bp，編碼505個(gè)氨基酸殘基，屬于銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(Ammonium Transporter Family)。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析其與不同植物物種的同源性。在不同氮素條件，real-time PCR結(jié)果顯示：在不同濃度KNO3處理?xiàng)l件下，MmAMT1基因在低濃度、中濃度NO3-處理?xiàng)l件下的表達(dá)量均波動(dòng)增加，而在高濃度NO3-處理?xiàng)l件下，MmAMT1基因的表達(dá)量波動(dòng)減少了

4、；在不同濃度(NH4)2SO4處理?xiàng)l件下，MmAMT1基因在低濃度 NH4+條件下表達(dá)量提高，在中濃度和高濃度 NH4+條件下，表達(dá)量降低；保持總氮量一定，不同氮源誘導(dǎo)下，MmAMT1基因僅在NH4NO3的處理?xiàng)l件下表達(dá)量降低。
　　2.桑樹(shù)低親和銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AMT2基因克隆、序列分析及表達(dá)分析
　　從魯桑育71-1品種克隆得到MmAMT2基因（國(guó)家專利申請(qǐng)?zhí)枺?01610203308.5），獲得完整的開(kāi)放閱讀框序列，其序列長(zhǎng)

5、度為1470bp，編碼489個(gè)氨基酸殘基，屬于Ammonium Transporter Family。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析其與不同植物物種的同源性。在不同氮素條件，real-time PCR結(jié)果顯示MmAMT2基因都會(huì)有不同程度的響應(yīng)以及表達(dá)量的變化。在不同濃度KNO3處理?xiàng)l件下，MmAMT2基因表達(dá)量變化的總體趨勢(shì)是先增加，直到最大值，然后下降，且在低濃度NO3-處理?xiàng)l件下的響應(yīng)度低于在中濃度和高濃度NO3-處理?xiàng)l件下的響應(yīng)度；在不同濃

6、度(NH4)2SO4處理?xiàng)l件下，MmAMT2基因在低濃度 NH4+條件下表達(dá)量提高，在中、高濃度 NH4+條件下表達(dá)量呈波動(dòng)降低；保持總氮量一定，不同氮源誘導(dǎo)下，MmAMT2基因的表達(dá)僅在KNO3處理?xiàng)l件下升高。
　　3.桑樹(shù)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1基因的克隆、序列分析及表達(dá)分析
　　從魯桑育71-1品種克隆得到MmNRT1基因（國(guó)家專利申請(qǐng)?zhí)枺?01610203634.6），其序列長(zhǎng)度為1062bp，獲得一個(gè)819bp的開(kāi)放

7、閱讀框序列，編碼272個(gè)氨基酸殘基，屬于MFS super family。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析其與不同植物物種的同源性。在不同氮素條件，real-time PCR結(jié)果顯示：在不同濃度KNO3處理?xiàng)l件下，MmNRT1基因表達(dá)量變化的趨勢(shì)均是先增加，然后下降。其響應(yīng)度在低濃度 NO3-處理?xiàng)l件下低于在中、高濃度 NO3-處理?xiàng)l件下；在不同濃度(NH4)2SO4處理?xiàng)l件下，MmNRT1在低濃度NH4+條件下表達(dá)量先升高后降低，變化不大。在中、高