蘋果果實(shí)酸度相關(guān)基因的篩選、克隆及表達(dá)分析.pdf

1、蘋果(MalusdomesticaB.)是世界上最重要的鮮食和加工果品之一。蘋果和以蘋果濃縮汁為主的加工業(yè)成為我國加入世貿(mào)組織以后最具國際市場競爭力的優(yōu)勢農(nóng)產(chǎn)品之一。我國長期以鮮食蘋果栽培為主，主栽品種如富士系列、元帥系列、嘎啦系列等均偏甜而少酸，導(dǎo)致加工產(chǎn)品酸度低，出口效益較低，生產(chǎn)上迫切需要發(fā)展適宜加工的酸度高的品種。為了研究蘋果酸度調(diào)控機(jī)制，本文利用分子標(biāo)記、分析代謝關(guān)鍵酶和cDNA-AFLP差異顯示的方法對控制果實(shí)酸度的基因進(jìn)行

2、了研究。主要結(jié)果如下： 1.蘋果果實(shí)酸/非(低)酸性狀的SSR標(biāo)記分析 利用蘋果上開發(fā)的140對SSR引物對東光和富士的F1代群體進(jìn)行了酸、非酸性狀的分子標(biāo)記篩選，得到一個與果實(shí)酸性狀連鎖的SSR標(biāo)記(CH03d12)，遺傳距離為8.89cM。共顯性分析表明酸(Ma)對非酸(ma)為完全顯性。 2.熱硼酸法提取蘋果果實(shí)RNA的改良 在原熱硼酸法的基礎(chǔ)上加入一些提取輔助劑并根據(jù)輔助劑的特性優(yōu)化提取步驟，改良

3、后的方法可以有效去除蛋白和多糖，從而可以從不同發(fā)育階段的蘋果果實(shí)中高效、穩(wěn)定的提取高質(zhì)量的RNA，所得RNA的A260/A230大于2.0，A260/A280介于1.8-2.1之間。所得RNA產(chǎn)量高，其中前期果實(shí)RNA產(chǎn)率在13.40μg/g之上，后期果實(shí)RNA產(chǎn)率在7.02μg/g之上。3.蘋果果實(shí)細(xì)胞質(zhì)型蘋果酸脫氫酶(cyMDH)基因的分離及其特征 利用不同物種的同源序列設(shè)計(jì)簡并引物，通過RT-PCR和RACE-PCR技術(shù)分

4、離了富士蘋果果實(shí)中的細(xì)胞質(zhì)型蘋果酸脫氫酶基因，命名為Mal-cyMDH,其全長為1,246bp，GenBank注冊號為DQ221207，基因組序列分析表明編碼區(qū)含有7個外顯子和6個內(nèi)含子。推斷的蛋白序列分析表明，Mal-cyMDH大部分氨基酸區(qū)域?yàn)橛H水結(jié)構(gòu)，有2個推測的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，其中在N端第9個氨基酸下游存在一個26氨基酸的強(qiáng)疏水結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)也發(fā)現(xiàn)于其它動植物和微生物的cyMDH中。同源性比較發(fā)現(xiàn)，該基因的氨基酸序列與其它植物具有

5、90％以上的同源性，尤其是與雙子葉植物的同源性更高，其中與桃子的同源性最高，達(dá)到96％；與動物和微生物的同源性也在50％以上。同時在該序列中也發(fā)現(xiàn)了cyMDH蛋白中高度保守的NAD結(jié)合基元TGAAGQI和催化基元“IWGNH”。這都說明本試驗(yàn)成功地從蘋果果實(shí)中克隆了cyMDH。 4.Mal-cyMDH的Southernblotting分析 BamHI，EcoRV和XbaI三種酶切后雜交結(jié)果顯示在蘋果基因組中cyMDH可能

6、存在三個拷貝。 5.Mal-cyMDH的NorthernBlotting分析 蘋果不同組織雜交表明，Mal-cyMDH在幼嫩的葉片、莖和發(fā)育后期的果實(shí)中大量表達(dá)，在根部表達(dá)較弱。cyMDH轉(zhuǎn)錄水平受果實(shí)發(fā)育調(diào)節(jié)，在兩種基因型后代果實(shí)中，該基因表達(dá)模式相似，都隨著果實(shí)的發(fā)育表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加，直到花后90天左右趨于穩(wěn)定。就兩個基因型的表達(dá)差異而言，花后7-60天，cyMDH在高酸果實(shí)中的表達(dá)強(qiáng)于低酸果實(shí)；而花后75-120天

7、低酸蘋果的表達(dá)信號反而有所加強(qiáng)；成熟期表達(dá)量則相似。蘋果酸含量測定表明在對應(yīng)發(fā)育時期高酸基因型蘋果酸含量明顯高于低酸基因型?？梢姡谵D(zhuǎn)錄水平上cyMDH的不同基因型的表達(dá)與蘋果酸含量的差異可能沒有相關(guān)性。6.原核表達(dá)及動力學(xué)參數(shù)測定將Mal-cyMDH基因編碼區(qū)克隆到原核表達(dá)載體pET30a-c(+)在OrigamiB(DE3)中表達(dá)了部分可溶的融合蛋白，酶活檢測發(fā)現(xiàn)重組蛋白具有較高的蘋果酸脫氫酶活性。融合蛋白動力學(xué)參數(shù)測定結(jié)果顯示，以

8、OAA和NADH為底物的蘋果果實(shí)cyMDH的Kcat和Kcat/kin遠(yuǎn)高于以Malate和NAD+為底物，說明蘋果果實(shí)中細(xì)胞質(zhì)型蘋果酸脫氫酶主要催化蘋果酸的合成。與以Malate為底物相比，蘋果果實(shí)中以O(shè)AA為底物cyMDH有高的Km和Vmax。Malate和OAA的競爭力分別高于NAD+和NADH。 7.高酸、低酸基因型中蘋果酸代謝關(guān)鍵酶的半定量PCR分析 高酸、低酸基因型中蘋果酸代謝關(guān)鍵酶基因的半定量RT-PCR結(jié)

9、果表明，催化蘋果酸合成的PEPC，負(fù)責(zé)蘋果酸降解的ME以及運(yùn)輸、儲藏有關(guān)的H+-ATPaseA在兩基因型間沒有表現(xiàn)出明顯差異，而調(diào)控蘋果酸運(yùn)輸、儲藏的另一個關(guān)鍵酶基因V-Ppase從花后90天左右在兩基因型間表現(xiàn)出了明顯差異，即高酸基因型明顯高于低酸基因型。 8.蘋果果實(shí)酸度相關(guān)基因的cDNA-AFLP差異篩選 采用64對AFLP引物組合對酸/低酸cDNA基因池進(jìn)行篩選，其中引物組合EcoRI-AAC/MseI-CAA在

10、兩個基因池間產(chǎn)生120bp左右多態(tài)性片斷，進(jìn)一步驗(yàn)證表明在6個高酸cDNA池成員和6個低酸cDNA池成員間表現(xiàn)出連續(xù)的差異，初步認(rèn)為該基因與果實(shí)低酸性狀有關(guān)，命名為Mal-DDNA。 9.Mal-DDNA基因分離及其特征 根據(jù)差異篩選所獲得的中間片段、5'片段和3'片段的重疊區(qū)域拼接出Mal-DDNA全長cDNA，該基因全長3,728bp，GenBank注冊號為DQ417661。DAS-TMfilter和TMpred分析

11、表明Mal-DDNA推斷的蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。LOCSVMpsi亞細(xì)胞定位分析表明該基因定位于細(xì)胞核(期望的準(zhǔn)確率為89％)，但PSORT預(yù)測的亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)(可信度為0.65)。基因銀行Blast分析表明Mal-DDNA及其推測的蛋白序列沒有明顯同源的基因。 10.Mal-DDNA的Southernblotting分析 EcoRLEcoRV和XbaI三種酶切后雜交結(jié)果顯示在蘋果基因組中cyMDH可能以單拷貝形式存在

12、。 11.Mal-DDNA的RT-PCR和NorthernBlotting分析 蘋果不同組織(包括根、莖、葉和果實(shí))雜交表明，Mal-DDNA在果實(shí)中專一性表達(dá)。不同發(fā)育階段的果實(shí)雜交顯示Mal-DDNA轉(zhuǎn)錄水平受果實(shí)發(fā)育調(diào)節(jié)，在高酸和低酸兩種基因型后代果實(shí)中該基因表達(dá)模式相似，總體上都隨著果實(shí)的發(fā)育表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加，但兩個基因型間存在明顯的差異，低酸基因型的表達(dá)要明顯高于高酸基因型。在低酸基因型中該基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)，除