授粉后黃瓜果實(shí)膨大生長(zhǎng)相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、本研究以非單性結(jié)實(shí)的全雌黃瓜材料為研究對(duì)象，利用cDNA-AFLP(cDNAamplifiedfragmentlengthpolymorphism)技術(shù)顯示開(kāi)花后未經(jīng)授粉0h黃瓜子房和授粉后6～72h這段時(shí)間的黃瓜幼果的基因表達(dá)差異，獲得64條差示帶；經(jīng)反向Northern斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證，其中5條主要在授粉后黃瓜幼果中特異表達(dá)，包括一條屬于編碼擴(kuò)張蛋白的新基因Cs-Expansin10(CsEXP10)。對(duì)CsEXP10的差示片段進(jìn)行了3

2、’-和5’-RACE(rapidamplificationofcDNAends)延伸，以及與已知EST序列的拼接，得到長(zhǎng)度為1191bp的cDNA序列。利用生物信息學(xué)方法，對(duì)CsEXP10基因序列及其氨基酸序列進(jìn)行分析，并對(duì)該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)。Southern雜交結(jié)果表明，該基因在黃瓜基因組中以單拷貝形式存在。研究工作主要包括以下幾個(gè)方面： 1.授粉后黃瓜幼果早期發(fā)育過(guò)程的觀察。對(duì)非單性結(jié)實(shí)的全雌黃瓜材料人工授粉，并

3、對(duì)授粉后0～6d的果實(shí)早期發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了觀察。從授粉后第2d開(kāi)始，幼果生長(zhǎng)加快，明顯伸長(zhǎng)。在授粉后3d到授粉后6d的這段時(shí)間里，幼果進(jìn)入迅速生長(zhǎng)狀態(tài)。 2.利用cDNA-AFLP技術(shù)分析授粉前后黃瓜幼果的基因表達(dá)差異。取開(kāi)花當(dāng)天未經(jīng)授粉0h子房作為授粉前的幼果樣品；取授粉后6h、12h、24h、36h、48h、72h幼果，并在RNA提取時(shí)等量混合后作為授粉后的幼果樣品。用上海生工的UNIQ-10柱式TRIZOL總RNA抽提試劑盒

4、分別提取授粉前和授粉后幼果樣品的總RNA，兩個(gè)幼果樣品總RNA的OD260/OD280值都在1.6～1.7之間；瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，28SrRNA亮于18SrRNA，且條帶清晰；用PolyATtract(r)mRNAIsolationSystemⅢ(Promega，USA)磁珠法純化PolyA+RNA。兩個(gè)幼果樣品mRNA的OD260/OD280值都在2.2～2.5之間。從電泳圖譜可以看出，mRNA從300bp至2kb以上的范圍呈彌散分

5、布，表明mRNA比較完整，基本沒(méi)有被降解，符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的需要。采用MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒(Sangon，Shanghai)合成單鏈cDNA(sscDNA)，sscDNA主要分布在500bp以上，呈彌散分布。E.coliDNA聚合酶Ⅰ和置換法合成cDNA第二鏈(dscDNA)。然后參照Bachem(1996)cDNA/AFLP技術(shù)和CLONTECH公司的AFLP分析系統(tǒng)Ⅱ試劑盒的方法進(jìn)行AseⅠ/TaqⅠ酶切、連接頭和PCR擴(kuò)

6、增。6﹪的測(cè)序膠電泳分離PCR產(chǎn)物。按Promega公司的銀染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行銀染顯示，X光膠片觀察燈下數(shù)碼成像和統(tǒng)計(jì)結(jié)果，分析樣品間的cDNA-AFLP差異。PCR選擴(kuò)產(chǎn)物經(jīng)6﹪的測(cè)序膠電泳分離后平均每條泳道有大于100bp的譜帶30～40條，轉(zhuǎn)錄本差示帶主要位于100～300bp之間。64對(duì)引物組合中有54.7﹪的引物對(duì)擴(kuò)增后呈現(xiàn)多態(tài)性，一般能顯出1～2條cDNA差示帶。開(kāi)花后授粉與不授粉的黃瓜幼果組織之間存在明顯的基因表達(dá)差異，表

7、明部分在子房發(fā)育時(shí)期表達(dá)的基因在授粉后子房或幼果膨大生長(zhǎng)期被關(guān)閉，而授粉后出現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)錄本。共獲得64條僅在授粉后出現(xiàn)的cDNA-AFLP差示片段。 3.反向Northern斑點(diǎn)雜交分析。回收授粉后幼果樣品中特異顯示的cDNA-AFLP凝膠帶，PCR擴(kuò)增、UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后點(diǎn)膜，分別以開(kāi)花當(dāng)天未經(jīng)授粉0h子房和授粉后6～72h幼果兩個(gè)樣品的sscDNA為探針，使用地高辛(DIG)核酸標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒(R

8、oche，Germany)進(jìn)行探針標(biāo)記、反向Northern斑點(diǎn)雜交和檢測(cè)。 4.差示片段的克隆與序列分析。將經(jīng)反向Northern斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證為陽(yáng)性的cDNA-AFLP差示片段用Pfu高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增、TaqDNA聚合酶加“A”尾后，克隆到pMD18-T載體上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞。委托公司測(cè)序。通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)在基因庫(kù)中搜尋同源序列，初步確認(rèn)所代表的基因，對(duì)新基因在GenBank上注冊(cè)。1條c

9、DNA片段(CO434610)屬expansin家族，與黃瓜CsEXP5和CsEXP9、棉花expansin的同源性最高，是一個(gè)新的黃瓜擴(kuò)張蛋白基因，可能直接參與了授粉后黃瓜果實(shí)的膨大生長(zhǎng)。鑒于目前在黃瓜中已發(fā)現(xiàn)9個(gè)擴(kuò)張蛋白基因，因此將它命名為黃瓜擴(kuò)張蛋白10(Cs-Expansin10，簡(jiǎn)稱(chēng)CsEXP10)。 5.CsEXP10基因cDNA序列的克隆。參照SMARTTMRACEcDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech，USA)方法

10、，用PowerScriptTM反轉(zhuǎn)錄酶合成授粉后3d幼果的cDNA第一鏈(sscDNA)。根據(jù)CsEXP10基因的cDAN-AFLP差示片段序列(CO434610)與黃瓜擴(kuò)張蛋白基因CsEXP1～CsEXP9的同源性分析結(jié)果，設(shè)計(jì)3，-RACE的基因擴(kuò)增特異引物，采用Pfu高保真DNA聚合酶進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為809bp的cDNA片段(AY940479)。根據(jù)3’-RACE結(jié)果設(shè)計(jì)5’-RACE的基因擴(kuò)增特異引物，RACE擴(kuò)

11、增后得到長(zhǎng)度為559bp的cDNA片段，將兩者拼接得到長(zhǎng)度為948bp的cDNA序列，其3’端完整而5，端不完整。在NCBI基因庫(kù)和EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性檢索發(fā)現(xiàn)，該序列與來(lái)源于黃瓜雌花花芽EST(CV004009)序列同屬一個(gè)基因，其間有214bp的堿基相同。用DNAstar軟件拼接后得到1191bp的cDNA序列片段，推導(dǎo)其編碼248個(gè)氨基酸。 6.CsEXP10基因的生物信息學(xué)分析。 6.1核苷酸序列和氨基酸序列

12、分析。CsEXP10基因cDNA序列中有3個(gè)CpG島，分別是48-98的區(qū)域，365-455的區(qū)域和539-703的區(qū)域；并且含有AluⅠ、HapaⅡ、RsaⅠ等十六種限制性?xún)?nèi)切酶。CsEXP10蛋白與其他9個(gè)己知的黃瓜擴(kuò)張蛋白基因CsEXP1～CsEXP9所推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為72﹪、63﹪、69﹪、77﹪、90﹪、90﹪、69﹪、73﹪和89﹪，而且與其他擴(kuò)張蛋白一樣，在N端具有保守的Cys殘基，C端具有保守的Trp殘基，

13、中部具有HFD、YR、GI、PV、RV、GG、RTF、NG、YF、TNV和GGD等一系列保守域。 6.2蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能分析。CsEXP10蛋白的分子量是26957.5Da，理論等電點(diǎn)是pI9.64，原子組成是C1208H1813N339O341S13，消光系數(shù)：在280nm時(shí)為56420，脂肪系數(shù)為65.32。不穩(wěn)定系數(shù)是33.52，說(shuō)明該蛋白是一個(gè)穩(wěn)定蛋白?？偲骄H水性為-0.123，說(shuō)明該蛋白是一個(gè)疏水蛋白。CsEXP1

14、0蛋白結(jié)構(gòu)中有四個(gè)α-螺旋和11個(gè)β-折疊，其中α-螺旋占到11﹪，β-折疊占到22﹪；有6個(gè)疏水性區(qū)域，5個(gè)跨膜區(qū)域，10個(gè)糖基化位點(diǎn)；有cAMP-和cGMP-依賴(lài)性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(cAMP-andcGMP-dependentproteinkinasephosphorylationsite)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(ProteinkinaseCphosphorylationsite)、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(Caseinkinase

15、Ⅱphosphorylationsite)和N端?；稽c(diǎn)(N-myristoylationsite)等活性位點(diǎn)。 7.CsEXP10基因的RT-PCR表達(dá)分析。以去除了基因組DNA污染的總RNA為模板，用MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒(Sangon，Shanghai)分別合成根、莖、葉和授粉后3d幼果的sscDNA。PCR擴(kuò)增檢測(cè)CsEXP10基因在不同組織的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CsEXP10基因只在授粉后3d的幼果中表達(dá)，

16、而不在根、莖和葉組織中表達(dá)。因此，初步認(rèn)為CsEXP10基因是一個(gè)果實(shí)特異表達(dá)基因。 8.CsEXP10基因的Northern雜交分析。取開(kāi)花前2～3cm幼小子房、開(kāi)花當(dāng)天未經(jīng)授粉0h子房、授粉后3d的幼果、授粉后10d和26d的果實(shí)果肉總RNA各10μg，經(jīng)1.2﹪甲醛變性凝膠電泳后按常規(guī)方法轉(zhuǎn)膜于帶正電荷的尼龍膜上，以CsEXP10基因cDNA片段(AY940479)在其家族中非保守的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)序列為探針

17、，雜交和檢測(cè)。Northern雜交結(jié)果顯示：CsEXP10基因主要在授粉后迅速膨大生長(zhǎng)的幼果組織中表達(dá)，其表達(dá)模式為“低-高-低”，即在開(kāi)花前2～3cm子房、開(kāi)花當(dāng)天未經(jīng)授粉0h子房中未能檢測(cè)出表達(dá)信號(hào)，在授粉后3d幼果和10d果實(shí)果肉中豐量表達(dá)，且在授粉后10d表達(dá)較3d強(qiáng)，在授粉后26d果實(shí)果肉中又未能檢測(cè)出表達(dá)信號(hào)。由此推測(cè)它與授粉后黃瓜果實(shí)膨大生長(zhǎng)有密切關(guān)系。 9.CsEXP10基因的Southern雜交分析。用改良的C