甜瓜果實蔗糖合成酶基因(SS)的克隆、表達(dá)分析及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、甜瓜（Cucumis melon L.）是世界性的重要園藝作物，糖分組成及含量是衡量甜瓜品質(zhì)的主要依據(jù)之一。蔗糖、葡萄糖和果糖是甜瓜果實中主要的可溶性糖，其含量和組成對果實品質(zhì)起重要作用，它們的含量和組成嚴(yán)格受蔗糖代謝酶調(diào)控，而蔗糖代謝酶包括蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）和轉(zhuǎn)化酶（Invertase），其中SS在蔗糖代謝中調(diào)控可逆反應(yīng)，主要是起分解作用。SS活性的降低是蔗糖積累的前提條件，改變SS的活性能改變蔗糖的代謝模式

2、。因此，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法改變蔗糖合成酶的活性對甜瓜品質(zhì)育種具有重要的意義。
　　 本研究首先通過RT-PCR及3′、5′RACE技術(shù)克隆到了甜瓜果實蔗糖合成酶基因全長cDNA，研究了該基因在組織器官和果實發(fā)育過程中的表達(dá)特異性，然后構(gòu)建了甜瓜果實SS基因的反義表達(dá)載體。以甜瓜自交系M01-3為材料，通過子房注射法將甜瓜果實反義SS基因進(jìn)行了甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化，目前已經(jīng)收獲轉(zhuǎn)基因種子；同時用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甜瓜，經(jīng)PCR檢測已經(jīng)

3、檢測出5株轉(zhuǎn)基因植株。研究的主要結(jié)果如下：
　　 1.通過RT-PCR及3′、5′RACE技術(shù)克隆到了甜瓜SS基因全長cDNA。測序結(jié)果表明該基因全長為2585bp，編碼804個氨基酸，命名為CmSS1。
　　 2.Real-Time PCR結(jié)果表明：CmSS1在甜瓜根、莖、葉、雄花、雌花和成熟果實中均有表達(dá)。其中在根中的表達(dá)量最高，在果實中的表達(dá)量最低；在甜瓜果實發(fā)育不同時期中，隨著果實發(fā)育時間的延長，CmSS1的表達(dá)

4、量逐漸降低，在花后5 d時表達(dá)量最高，花后30 d表達(dá)量最低。
　　 3.將克隆在pMD18-T載體上的甜瓜CmSS1基因用BamHI和SalI酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.1％瓊脂糖凝膠電泳后回收1.4 kb的片段，將該片段與經(jīng)相同的酶切后的植物表達(dá)載體pBI121進(jìn)行連接，這樣獲得的重組質(zhì)粒片段為反向插入35S啟動子之后，TNOS終止子之前。經(jīng)酶切和PCR檢測表明，成功構(gòu)建了甜瓜反義CmSS1基因的植物表達(dá)載體。
　　 4.利