甜瓜果實(shí)八氫番茄紅素合成酶基因的克隆、表達(dá)分析及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、甜瓜（Cucumis melo L.）是世界上重要的園藝作物之一，甜瓜果實(shí)含有大量的類胡蘿卜素，其中β-胡蘿卜素含量最為豐富。Β-胡蘿卜素被人體消化吸收后轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素A，所以β-胡蘿卜素也被稱為維生素A原。醫(yī)學(xué)研究表明，類胡蘿卜素在增強(qiáng)人體免疫力、防止心血管疾病和癌癥等方面具有重要的作用。八氫番茄紅素合成酶是甜瓜類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵酶，對甜瓜果實(shí)類胡蘿卜素的合成起著關(guān)鍵作用，因此，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段研究甜瓜八氫番茄紅素合成酶的

2、活性及其調(diào)節(jié)機(jī)制對改善甜瓜品質(zhì)有重要意義。本研究通過HPLC測定了不同基因型甜瓜果實(shí)發(fā)育時(shí)期β-胡蘿卜素含量，克隆到了甜瓜果實(shí)Psy基因全長cDNA，并對該基因進(jìn)行了表達(dá)特性分析和遺傳轉(zhuǎn)化研究。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.利用HPLC測定了不同基因型甜瓜果實(shí)發(fā)育時(shí)期β-胡蘿卜素含量，結(jié)果表明，三個(gè)基因型（M01-3、Homoken和J-01）甜瓜在果實(shí)發(fā)育中，β-胡蘿卜素含量的變化趨勢是一致的，即果實(shí)發(fā)育前期，

3、β-胡蘿卜素含量很低。在果實(shí)接近成熟的時(shí)候，β-胡蘿卜素含量迅速升高，成熟后，β-胡蘿卜素含量又有所下降。橙色果肉的Homoken臨近成熟的果實(shí)中β-胡蘿卜素含量最高，為白色果肉的M01-3和淺綠色果肉的J-01的十幾倍到幾十倍。
　　 2.根據(jù)GeneBank中登記的甜瓜果實(shí)的Psy基因的序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR技術(shù)從M01-3甜瓜果實(shí)中克隆到了Psy基因，該基因全長1443 bp，編碼422個(gè)氨基酸。在GenBank中

4、登記號為GU361622。利用Real Time RT-PCR 進(jìn)行了該基因的表達(dá)特性分析。結(jié)果表明，Psy基因在根、莖、葉、花和果實(shí)中的表達(dá)水平不同，在果實(shí)發(fā)育前期，Psy基因的相對表達(dá)量很低，在接近成熟時(shí)達(dá)到最大值，成熟期又趨于下降。Psy基因在甜瓜果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)趨勢與β-胡蘿卜素的變化趨勢一致。
　　 3.Psy基因編碼區(qū)與原核表達(dá)載體pET-30a(+)連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-Psy

5、，并用8％的SDS-PAGE電泳分析。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的目的蛋白分子量為46.7 kDa，說明該基因經(jīng)誘導(dǎo)后可正確表達(dá)PSY蛋白
　　 4.甜瓜Psy基因的編碼區(qū)連接在pMD18-T克隆載體上并測序。正、反向重組質(zhì)粒pMD18-T-Psy分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切并與經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切的表達(dá)載體pBI121連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，獲得正、反義表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將正、反義表達(dá)載體分別對甜瓜進(jìn)行遺