石磺進(jìn)化相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、進(jìn)化論觀點認(rèn)為生命起源于海洋,生物從水棲向陸棲進(jìn)化,兩棲類是進(jìn)化過程中產(chǎn)生的過渡態(tài)物種。石磺科(Onchidiidae)貝類,隸屬于軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、肺螺亞綱(Pulmonata)、縮眼目(Systellommatophora),其幼蟲生活在水中,變態(tài)發(fā)育后具有明顯的兩棲性,被認(rèn)為是無脊椎動物由淺海向陸地進(jìn)化的過渡類群,具有重要的學(xué)術(shù)價值。我國華東地區(qū)分布著瘤背石磺(Onchidium st

2、ruma)、平疣桑椹石磺(Platevindex mortoni)、里氏擬石磺(Paraoncidium reevesii)和紫色疣石磺(Peronia verruculata),生存環(huán)境由潮間帶向潮上帶遷移,產(chǎn)生出具有時空代表性的表型差異。本論文依據(jù)石磺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,開發(fā)出四種石磺間表型進(jìn)化相關(guān)基因,Os-NMHC,Os-RYR,Os-IP3R,Os-MEK,Os-IP3K的cDNA序列,通過RT-PCR技術(shù)探究基因的種間差異表達(dá)趨勢

3、,從基因表達(dá)水平探究石磺表型進(jìn)化差異的同時,也初步地探究了NMHC基因亞型進(jìn)化節(jié)點問題以及相似鈣調(diào)蛋白RYR和IP3R基因的進(jìn)化趨勢。
  首次于石磺科貝類中克隆出一條差異表達(dá)的Ⅱ型非肌肉型肌球蛋白重鏈基因(NMHCⅡ)的cDNA全長,將其命名為Os-NMHC基因。其序列全長6057bp,包括5733bp的開放閱讀框,236bp的5’端非翻譯區(qū),88bp的3’端非翻譯區(qū),共編碼1910個氨基酸;預(yù)測蛋白質(zhì)等電點為5.26,相對分子

4、質(zhì)量為220.46KD;通過Phyre2程序和Pymol軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)圖,預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和β折疊為主;通過Clustalx和dnaMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對,發(fā)現(xiàn)其與爪蟾NMHC II A序列一致度為60.37%,與爪蟾NMHC II B序列相似度為61.47%;通過Bayes軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)其與加州海兔親緣關(guān)系最近。通過QRT-PCR技術(shù)檢測,發(fā)現(xiàn)該基因在四種石磺的背部、腹部、腹足部、肺囊、心臟、神經(jīng)節(jié)中

5、均有不同程度的表達(dá)。種間表達(dá)水平與進(jìn)化趨勢相一致,依次為:瘤背石磺≥平疣桑椹石磺>里氏擬石磺>紫色疣石磺。對于石磺Os-NMHC基因的研究,將有助于NMHC亞型進(jìn)化節(jié)點問題的探究,并為石磺科貝類由淺海向濕地進(jìn)化的機制研究提供新視角。
  RYR和IP3R是兩種結(jié)構(gòu)相似、功能相近的鈣調(diào)蛋白,通過RACE技術(shù)于瘤背石磺中開發(fā)出Os-RYR和Os-IP3R的cDNA3’末端保守區(qū)序列。Os-RYR核酸序列1253bp,包括83bp的3’

6、非編碼區(qū),翻譯氨基酸殘基376個,與加州海兔RYR末端保守區(qū)序列一致度為94%。Os-IP3R核酸序列4574bp,包括1561bp的3’非編碼區(qū),翻譯936個氨基酸殘基,與加州海兔IP3R末端保守區(qū)序列一致度為85%。Clustal omega在線比對,Os-RYR和Os-IP3R鈣離子通道在GXRXGGGXGD處的序列高度保守,證明該序列對于形成離子通道具有重要作用。Os-IP3R離子通道保守區(qū)與加州海兔IP3R離子通道保守區(qū)序列相

7、似度為94%,蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)重合度極高。QRT-PCR分析結(jié)果顯示,Os-RYR和Os-IP3R在紫色疣石磺中表達(dá)水平均最低,Os-RYR在石磺物種間的表達(dá)水平不具有梯度趨勢,Os-IP3R在瘤背石磺、平疣桑椹石磺、紫色疣石磺中表達(dá)量呈梯度下降趨勢。Os-IP3R/Os-RYR表達(dá)百分比在紫色疣石磺、平疣桑椹石磺、瘤背石磺中呈梯度上升趨勢,說明功能相同結(jié)構(gòu)相似的兩種鈣調(diào)蛋白基因Os-IP3R和Os-RYR,在石磺由淺海向濕地進(jìn)化過程中,

8、對Os-IP3R的鈣調(diào)功能呈現(xiàn)增加的趨勢,其表達(dá)具有一定得趨向性。
  以高等動物VEGF信號通路分子為基礎(chǔ),結(jié)合石磺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,認(rèn)為石磺中VEGF信號通路(血管內(nèi)皮生長因子信號通路)中不存在IP3K/AKT和mTOR通路途徑,并篩選出與鈣調(diào)蛋白Os-IP3R具有互作關(guān)系的Os-IP3K通路分子以及表皮生長相關(guān)的下游通路分子Os-MEK??寺×霰呈荗s-MEK核酸序列全長1201bp,包括40bp5’的非編碼區(qū)和83bp的3’

9、非編碼區(qū),共編碼368個氨基酸殘基,與加州海兔MEK基因編碼氨基酸序列一致度達(dá)到82%。Os-MEK蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和少量無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。克隆Os-IP3K核酸序列全長3661bp,不包括3’和5’端非編碼區(qū),編碼721個氨基酸殘基。RT-PCR分析結(jié)果顯示Os-IP3K在瘤背石磺各組織中的表達(dá)趨勢與Os-IP3R表達(dá)趨勢一致。在平疣桑椹石磺神經(jīng)節(jié)中不表達(dá)Os-IP3R,但是Os-IP3K的表達(dá)水平卻是各組織

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