石磺科貝類MSTN和MyHC基因的克隆和表達分析.pdf

1、石磺科貝類是在海水、淡水、陸地都有分布的一類生物，它們的生活區(qū)域分布于淺海、灘涂潮間帶甚至潮上帶，生活環(huán)境具有典型的兩棲性，其皮膚呼吸能力的強弱、肌肉的結(jié)構(gòu)、角質(zhì)層的形成和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育程度因生活環(huán)境的不同表現(xiàn)出明顯的生物適應性，因此石磺科貝類又被認為是海洋無脊椎動物從水生到陸生進化的過渡類群。為探究肌肉在石磺由海洋向陸地進化過程中發(fā)揮作用的分子機制，探討其在該過程中產(chǎn)生的適應性進化，本論文以我國分布廣泛且研究較為深入的4種石磺作為實驗

2、對象，以已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為基礎，比較分析后篩選、克隆了石磺肌肉相關(guān)基因，分析在不同種石磺、各組織中的表達狀態(tài)，并對4種石磺進化關(guān)系進行了初步探討。
　　(1)采用RACE方法從瘤背石磺（Onchidium struma）肌肉中首次克隆到MSTN cDNA的全長并做了相應的組織表達分析。研究結(jié)果表明瘤背石磺 MSTN基因cDNA全長2667bp，5′-非翻譯區(qū)（5′-UTC）的長度為374bp，3′端非翻譯區(qū)（3′-UTC）的長度

3、為643bp，1650bp的開放閱讀框（ORF），對應編碼549個氨基酸。預測該基因編碼的蛋白質(zhì)原子總量為8776，分子式為 C2774H4331N783O862S26，分子質(zhì)量約為63.27kD，理論等電點為6.02，信號肽預測結(jié)果顯示MSTN蛋白N端具有21個氨基酸長度的信號肽。瘤背石磺MSTN具有MSTN的共同特征，包括蛋白酶水解位點RSRR和C端多肽生物活性區(qū)以及9個保守的半胱氨酸殘基。系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果顯示瘤背石磺MSTN與加

4、州海兔MSTN的親緣關(guān)系最近。RT-PCR結(jié)果顯示，MSTN基因在各個組織中均有表達；含肌纖維組織中的表達量低于內(nèi)臟器官的表達量，在瘤背石磺肝胰腺中的表達量最高，瘤背石磺腹足中表達量最低(P＜0.05)。
　　(2)以石磺科4種貝類轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎，瘤背石磺（Onchidium struma）、里氏擬石磺（Paraoncidium reevesii）、平疣桑椹石磺（Platevindex mortoni）、紫色疣石磺（Peroni

5、a verruculata）為實驗材料克隆了4種石磺的MyHC基因的編碼區(qū)全長并進行了分析，結(jié)果表明瘤背石磺MyHC基因cDNA全長7566bp，開放閱讀框為5895bp，對應編碼1964個氨基酸，同時包括228bp的5’端非翻譯區(qū)，1443bp的3’端非翻譯區(qū)。預測瘤背石磺MyHC基因編碼的蛋白質(zhì)由31713個原子組成，分子式為C9765H15897N2849O3150S52，相對分子量約為225.28kD，理論等電點為5.56，信號

6、肽預測結(jié)果表明瘤背石磺MyHC蛋白 N端具有29個氨基酸長度的信號肽。瘤背石磺MyHC具有兩個保守結(jié)構(gòu)域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l，且親水性氨基酸集中在Myosin_tail_l。里氏擬石磺MyHC的cDNA全長7598bp，包括5904bp的開放閱讀框，對應編碼1967個氨基酸，276bp的5′端非翻譯區(qū)，1418bp的3′端非翻譯區(qū),預測編碼蛋白原子總量31713，分子式為 C9765H15894N2860

7、O3156S56；平疣桑椹石磺MyHC的cDNA全長7115bp，預測開放閱讀框為5904bp，預測編碼1967個氨基酸，5′-UTC為165bp，3′-UTC為1046bp，預測編碼蛋白原子總量31776，分子式為C9785H15921N2865O3153S52；紫色疣石磺MyHC的cDNA全長7115bp，預測ORF為5904bp，對應編碼1967個氨基酸，192bp的5′-UTC，1059bp的3′-UTC，預測編碼蛋白原子總量3

8、1730，分子式為C9762H15895N2859O3157S57。石磺科貝類MyHC具有兩個保守結(jié)構(gòu)域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l，且親水性氨基酸集中在Myosin_tail_l。該實驗結(jié)果對深入研究石磺肌球蛋白重鏈基因的原位雜交實驗、western blot檢測奠定了基礎。
　?。?）為探究石磺科貝類肌肉相關(guān)基因在各組織中的表達差異，分別取瘤背石磺的背部皮膚、腹部皮膚、腹足、肺囊、肝胰腺、口球、兩性腺、

9、蛋白腺8個組織以及里氏擬石磺、平疣桑椹石磺、紫色疣石磺的背部皮膚、腹部皮膚、腹足、肺囊4個組織進行熒光定量檢測。MyHC基因在4種石磺不同組織中的熒光定量結(jié)果顯示：背部皮膚中，瘤背石磺的表達量最高，里氏擬石磺表達量最低，且表達差異顯著；腹部皮膚中，平疣桑椹石磺表達量最高；腹足中平疣桑椹石磺表達量最高，瘤背石磺次之，里氏擬石磺表達量最低，表現(xiàn)出顯著差異；肺囊中整體表達量低，瘤背石磺表達量最高，未出現(xiàn)顯著性差異。瘤背石磺MSTN、MyHC基