桑樹MCAX-1和MRD22基因的克隆及序列與表達分析.pdf

1、本文在本課題組構建的桑樹幼葉cDNA文庫的基礎上獲得了2個ESTs,克隆了桑樹 Ca2+/H+反向轉運體蛋白基因和脫水應答蛋白基因,并對獲得的序列進行了分析和功能推斷,用脅迫誘導的方法對這2個基因進行功能驗證。本論文的主要研究內容與結果如下:
　　1、桑樹Ca2+/H+反向轉運體蛋白基因CAX的克隆,序列分析及誘導表達研究
　　植物體內的Ca2+/H+反向轉運體在Ca2+介導的營養(yǎng)和信號轉導中發(fā)揮著重要的作用。選擇桑樹幼葉c

2、DNA文庫中功能注釋為Ca2+/H+反向轉運體基因CAX的一條EST序列設計引物,通過cDNA末端快速擴增(RACE)與反轉錄PCR(RT-PCR)在桑品種育7-11的幼葉中克隆獲得該基因的完整序列,命名為MCAX-1(GenBank登錄號:JN716318)。序列分析顯示:MCAX-1全長1784 bp,包括197 bp的5′端非翻譯序列和243 bp的3′端非翻譯序列,含有1個1344 bp的完整ORF,編碼447個氨基酸殘基,預測

3、蛋白質分子質量為47.93 kD,等電點為5.67。構建的桑樹和其他植物基于Ca2+/H+反向轉運體蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進化樹顯示:桑樹與鹽地堿蓬(Suaeda salsa)、毛果楊(Populus trichocarpa)蓖麻(Ricinus Communis)等有較近的親緣關系。半定量RT-PCR分析表明:MCAX-1在桑樹幼芽、嫩葉、根和幼花中表達量較高,在韌皮部、木質部和成熟果實中的表達量較低;MCAX-1在低溫脅迫下的表達量減少

4、,-1℃時幾乎無表達,在干旱脅迫下的表達量隨著脅迫時間延長逐漸達到最大值之后再直線降低,在鹽分脅迫初期的表達量無變化,但脅迫18d時表達量明顯降低。初步推測MCAX-1與桑樹的抗逆性能有一定關聯(lián)。
　　2、桑樹脫水應答蛋白基因MRD22的克隆,序列分析及誘導表達研究
　　從已構建的桑樹幼葉 cDNA文庫得到了一個編碼桑樹脫水應答(Dehydration-responsive Protein)基因的一段序列,通過RACE與RT

5、-PCR結合首次獲得了這個基因的完整序列,命名為MRD22(GeneBank登錄號:JQ804833)。序列分析表明,MRD22全長1503bp,存在334bp的5’端非翻譯序列(5’-UTR)和563bp的3’端非翻譯序列(3’-UTR),其開放讀碼框(ORF)長606bp,編碼201個氨基酸,預測蛋白質分子質量為54.28KD,等電點為9.35。構建的桑樹和其他植物基于脫水應答蛋白基因氨基酸序列系統(tǒng)進化樹顯示:桑樹與毛楊果(Popu

6、lus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)、茶樹(Camellia sinensis)、棉花(Gossypium hirsutum)與海島棉(Gossypium barbadense)等有較近的親緣關系。MRD22在低溫脅迫下的表達量出現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài);在干旱脅迫下,MRD22的表達量隨著脅迫時間延長逐漸達到最大值之后再直線降低;在鹽分脅迫的情況下,基因 MRD22的表達量處于明顯波動狀態(tài),但當在264h時表