FMDV結(jié)構(gòu)基因的克隆與序列分析和VP1的表達(dá)及間接ELISA方法的建立.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-MouthDisease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseaseVirus，F(xiàn)MDV)引起的牛、羊、豬等偶蹄動物感染的一種烈性傳染病，該病的發(fā)生和流行嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此世界各國相當(dāng)重視對該病的研究和防治?？谔阋卟《疽職び蒝P1、VP2、VP3、VP44種結(jié)構(gòu)蛋白各60個(gè)拷貝組成，其中VP1蛋白又稱1D蛋白，其基因位于基因組的2977-3615位，編

2、碼213個(gè)氨基酸，VP1暴露在病毒顆粒的表面，是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要成分。 本試驗(yàn)以口蹄疫病毒的細(xì)胞培養(yǎng)毒為材料，通過RT-PCR方法獲得了此株病毒結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，同法獲得了口蹄疫疫苗株結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列。對此株口蹄疫病毒與參考毒株的VP1、VP2、VP3、VP4的各核苷酸序列進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)主要差異在可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的VP1上，根據(jù)VP1基因序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(國際上通用VP1基因繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹)，發(fā)現(xiàn)此株病毒屬

3、于O型FMDV的SEA拓?fù)湫?。將此株口蹄疫病毒與口蹄疫疫苗株進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，VP1完全相同，差異在VP2、VP3上。 以已經(jīng)構(gòu)建好的pMD18-T-VP1質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到FMDVVP1目的基因，將目的基因克隆到pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化宿主菌TG1后得到重組質(zhì)粒pMD18-T-VP1，測序證明此VP1基因序列準(zhǔn)確無誤。對重組質(zhì)粒pMD18-T-VP1和原核表達(dá)載體pET-30a(+)分別以相同的限制性內(nèi)切酶SacI和Hi

4、ndⅢ消化，經(jīng)連接酶連接，轉(zhuǎn)化宿主菌TG1，篩選出陽性克隆pET-30a(+)-VP1。隨后將此陽性質(zhì)粒pET-30a(+)-VP1轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)pLysS中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)VP1基因的表達(dá)，收集不同時(shí)間的菌液進(jìn)行SDS-PAGE、Westernblotting分析和dot-ELISA分析，結(jié)果表明VP1基因在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)，表達(dá)的目的蛋白的分子量約為34ku，但表達(dá)產(chǎn)物未檢測到抗原性。 對重組質(zhì)粒pMD

5、18-T-VP1和真核表達(dá)載體pBlueBacHis2A分別以相同的限制性內(nèi)切酶SacI和HindⅢ消化后，經(jīng)連接酶連接，轉(zhuǎn)化宿主菌TG1，篩選出陽性克隆pBlueBacHis2A-VP1。將pBlueBacHis2A-VP1質(zhì)粒與Bac-N-BlueTMDNA共轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，噬斑篩選重組病毒，將純化的重組病毒感染Sf9細(xì)胞，表達(dá)了32.6ku目的蛋白條帶，dot-ELISA分析表明表達(dá)產(chǎn)物具有抗原性。 以真核表達(dá)的融合蛋