豬抵抗素基因克隆，表達及ELISA檢測方法的建立.pdf

1、本研究根據(jù)Genbank中豬抵抗素(resistin)基因cDNA序列設(shè)計引物，采用RT-PCR的方法成功的從豬脂肪組織中擴增到RSTN基因cDNA片段，并將其克隆到pMDl8-T載體中進行序列測定，結(jié)果表明：RSTN基因cDNA長度為330bp，編碼109個氨基酸和一個終止密碼子。它們與Genbank中豬RSTN基因cDNA核苷酸序列同源性為100％，與Genbank其它5個物種(牛、狗、人、大鼠和小鼠)的cDNA序列進行比較，發(fā)現(xiàn)核

2、苷酸序列同源性在67％～87％之間，氨基酸序列同源性在56％～79％之間，說明不同物種之間RSTN基因差異較大。 根據(jù)RSTN基因測序結(jié)果設(shè)計另一對引物，用PCR方法擴增到RSTN基因并將其亞克隆至pET-32a(+)表達載體，獲得重組質(zhì)粒pET-RSTN。用pET-RSTN轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3)感受態(tài)細胞，用IPTG誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，重組resistin蛋白分子量大小約30KD。對表達條件如溫

3、度、IPTG濃度及誘導(dǎo)時間進行優(yōu)化并用SDS-PAGE檢測。結(jié)果表明，30℃、4h、IPTG濃度為1mmol／L時，可溶性重組resistin的表達量最高。Western blot檢測結(jié)果表明，重組resistin可與其抗體發(fā)生特異性結(jié)合，并在分子量大小約30KD處形成特異性反應(yīng)條帶，表明RSTN基因已在大腸桿菌成功表達。 用50％Ni-NTA柱對重組resistin進行純化，在SDS-PAGE凝膠上為單一電泳條帶。用純化的重

4、組resistin蛋白免疫健康家兔，制備抗血清，初步建立了resistin檢測的ELISA方法。結(jié)果表明，該方法具有較強的特異性和靈敏度，抗原-抗體最佳工作濃度為1：200和1：400，resistin最低檢出限量為193.75ng／mL。 綜上所述，本研究成功克隆了豬RSTN基因cDNA序列，并且構(gòu)建了resistin原核表達載體，獲得了可溶性重組resistin蛋白，初步建立了resistin檢測的ELISA方法，