桑樹(shù)CBF1和BADH基因的克隆及分析.pdf

1、本試驗(yàn)通過(guò)參考其它植物同源基因的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,以桑樹(shù)(育71-1)的扦插苗為試驗(yàn)材料,克隆了桑樹(shù)CBF1轉(zhuǎn)錄因子基因、甜菜堿醛脫氫酶基因的cDNA全長(zhǎng)序列,并對(duì)獲得序列進(jìn)行了分析、表達(dá)和功能驗(yàn)證等。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　1、桑樹(shù)CBF1轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆,表達(dá)分析及5'端啟動(dòng)子序列的克隆與分析
　　本試驗(yàn)利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了桑樹(shù)CBF1基因的cDNA序列,命名為MCBF1,(GenBank登錄號(hào)JX

2、186750)。序列分析結(jié)果表明該基因序列全長(zhǎng)為1134bp,包括693bp的開(kāi)放閱讀框(ORF),87bp的5'UTR和354bp的3'UTR。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示其演繹的氨基酸序列具有AP2結(jié)構(gòu)域及其兩端的CBF家族特有的多肽序列,與其它植物CBF基因翻譯的氨基酸序列同源性較高。將構(gòu)建的pET28a-MCBF1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后,誘導(dǎo)表達(dá)的MCBF1重組蛋白分子量與預(yù)測(cè)大小基本一致。構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示:桑樹(shù)與柑橘(Citrusj

3、ambhiri)、垂枝樺(Betulapendula)和切花月季(Rosahybridcultivar)的親緣關(guān)系較近。半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),MCBF1基因在未經(jīng)過(guò)4℃處理的對(duì)照桑苗嫩葉中無(wú)表達(dá),在4℃處理過(guò)的桑苗幼葉中均有表達(dá),而在處理6天后相對(duì)表達(dá)量最高。通過(guò)染色體歩移法克隆了該基因起始密碼子上游約400bp的堿基序列,并利用在線軟件PLACE對(duì)其進(jìn)行了分析。
　　2、桑樹(shù)甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因的cDNA全長(zhǎng)克隆

4、及序列分析
　　從桑樹(shù)中克隆了甜菜堿醛脫氫酶基因的cDNA序列,命名為MBADH,(GenBank登錄號(hào)KC244769)。序列分析結(jié)果表明桑樹(shù)的BADH基因cDNA序列全長(zhǎng)1883bp,可編碼501個(gè)氨基酸,蛋白分子量為54.6KD,等電點(diǎn)pI為5.19。氨基酸序列分析顯示,MBADH蛋白中具有與酶結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的十肽序列(VSLELGGKSP),同源分析表明BADH基因在桑樹(shù)與其它植物之間有很高的保守性?；谏?shù)和其他18個(gè)物種