擬南芥抗寒基因CBF1的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建及雞冠花離體再生體系的建立.pdf

1、冷馴化是一個由數(shù)百個基因協(xié)同調(diào)控的復(fù)雜的生物過程。在這個由眾多基因構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，少數(shù)關(guān)鍵性調(diào)控基因控制著大量基因的表達(dá)。C-repeatbindingfactor(CBF)基因是冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)節(jié)子，該基因的過表達(dá)植株表現(xiàn)出抗寒性的增強(qiáng)。本實驗以擬南芥野生型ArabidopsisthalianaC24為材料，從C24基因組中克隆CBF1(C-repeatbindingfactor1)全序列，連接到表達(dá)載體pCAMBIA1300

2、中，成功構(gòu)建了CBF1的真核表達(dá)載體。此外，同時建立雞冠花組織培養(yǎng)再生體系，用于后期CBF1的遺傳轉(zhuǎn)化和抗凍性轉(zhuǎn)基因植株的獲得。主要內(nèi)容如下： 1擬南芥CBF1基因的克隆與鑒定：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的擬南芥CBF1基因序列，設(shè)計含有限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI酶切位點的上、下游特異引物，通過PCR獲得CBF1基因767bp全序列。將獲得的CBF1基因連接到pMD18-T載體中，用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，構(gòu)建克隆載

3、體pMD18T-CBF1。通過藍(lán)白斑篩選、菌落PCR以及雙酶切鑒定，測序，挑取正確的克隆進(jìn)行下一步操作。 2CBF1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建：將pMD18T-CBF1和表達(dá)載體pCAMBIA1300均用XbaI和SacI雙酶切后回收目的基因CBF1和載體pCAMBIA1300，T4連接酶連接過夜，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，酶切鑒定獲得陽性克隆。將重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-CBF1熱激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，鑒定后的陽性

4、菌株用于花卉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。 3雞冠花再生體系的建立：以雞冠花頂芽為外植體，通過愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)建立了再生體系。分化培養(yǎng)基為：MS+2.0㎎/L6-BA+0.5㎎/LNAA+0.5㎎/LIAA，愈傷組織的誘導(dǎo)率為86.7％，不定芽的誘導(dǎo)率為71.7％。1/2MS培養(yǎng)基生根誘導(dǎo)，生根率為92％。為下一步CBF1基因的遺傳轉(zhuǎn)化奠定了實驗基礎(chǔ)。 我們成功克隆了CBF1基因并構(gòu)建出CBF1真核表達(dá)載體，建立了雞冠花再生體系