大豆鐵蛋白基因的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建及對擬南芥的轉(zhuǎn)化.pdf

1、鐵缺乏是世界范圍內(nèi)人類面臨的嚴(yán)重營養(yǎng)問題。在禾谷類作物中表達(dá)豆類鐵蛋白,以增加食物中的鐵攝入量,是改良食品中鐵含量的一個理想途徑。本實(shí)驗(yàn)以ncbi數(shù)據(jù)庫獲得已知豆類鐵蛋白序列為模板,借助軟件Prime5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì),通過反轉(zhuǎn)錄方法從豫豆8號中克隆到cDNA片段,測序結(jié)果表明該基因cDNA全長752bp；利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對分析發(fā)現(xiàn)該序列與大豆(M64337)鐵蛋白同源性高達(dá)98％以上,編碼250氨基酸。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件

2、及相關(guān)網(wǎng)站對其功能位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)功能域分析,結(jié)果顯示該基因具有1個FER-RITIN-LIKE功能域,2個鐵蛋白基因家族鐵結(jié)合區(qū)域的信號序列,6個磷酸化位點(diǎn)等重要功能位點(diǎn)。
　　 本研究表達(dá)載體采用Gateway重組克隆技術(shù)構(gòu)建,目標(biāo)基因連入pGWC后即為入門克隆(Entry Clone),通過與表達(dá)載體做LR反應(yīng)構(gòu)建目標(biāo)基因的表達(dá)載體。通過抗性篩選、PCR檢測證實(shí)大豆鐵蛋白ferritin基因植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。通過農(nóng)桿菌電擊轉(zhuǎn)

3、化的方法將表達(dá)載體PLEELA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌pMP90RK中。
　　 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花粉管通道法將大豆鐵蛋白ferritin基因?qū)霐M南芥植株,獲得抗除草劑抗性的植株,提取抗性植株葉片DNA對其進(jìn)行PCR檢測,鑒定結(jié)果是四株為陽性,初步證實(shí)大豆鐵蛋白基因已經(jīng)整合進(jìn)擬南芥基因組中。
　　 本研究對大豆鐵蛋白基因的克隆、植物表達(dá)載體的構(gòu)建及對擬南芥的轉(zhuǎn)化,為進(jìn)一步研究大豆鐵蛋白ferdtin基因的功能和利用該基因進(jìn)行禾谷類作物