人乳鐵蛋白基因的克隆及其在乳酸菌中的表達(dá).pdf

1、[目的]
　　 乳鐵蛋白也稱乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，是乳汁中主要的鐵結(jié)合蛋白，廣泛分布于多種組織、細(xì)胞內(nèi)，具有非特異性免疫、參與鐵代謝和細(xì)胞生長調(diào)節(jié)等功能。與其它動(dòng)物乳鐵蛋白相比，人乳鐵蛋白(hLF)更適合用于人類的營養(yǎng)保健。選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行hLF基因的異源表達(dá)，是將hLF用于人類營養(yǎng)保健的重要途徑之一。在目前常用的表達(dá)系統(tǒng)中，可用于發(fā)酵生產(chǎn)酸奶的食品級(jí)乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。本研究通過克隆hLF基因，并構(gòu)建出用于hLF表達(dá)

2、，以乳糖為選擇標(biāo)記的食品級(jí)乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)，目的就是要構(gòu)建出可表達(dá)hLF，并最終可用于生產(chǎn)富含hLF酸牛奶的重組乳酸菌。
　　 [方法]
　　 本研究用RT-PCR方法從人乳腺組織中擴(kuò)增hLF cDNA序列，將其克隆入pMD18-T載體后進(jìn)行測(cè)序并與從GeneBank中收藏的hLF基因?qū)Ρ辱b定。選擇序列比對(duì)正確的hLF基因與乳酸乳球菌表面表達(dá)載體pNZ8149進(jìn)行連接，電擊轉(zhuǎn)化入食品級(jí)乳酸乳球菌NZ3900細(xì)胞。重組菌以1

3、0ng/mL乳鏈菌肽(Nisin)誘導(dǎo)表達(dá)；采用SDS-PAGE和Western blot分析觀察目的蛋白的表達(dá)情況；采用超聲破碎重組菌收集上清液，通過抑菌圈實(shí)驗(yàn)觀察目的蛋白是否具有生物學(xué)活性。
　　 [結(jié)果]
　　 用RT-PCR方法從人乳腺組織中成功克隆出hLF cDNA序列，測(cè)序結(jié)果表明克隆出hLF cDNA序列同Rey，M.W等人提交的hLF基因的cDNA序列的同源性為99.8％。
　　 表達(dá)載體及重組菌

4、的構(gòu)建試驗(yàn)結(jié)果表明，成功構(gòu)建出了以乳糖為選擇標(biāo)記、可表達(dá)hLF的重組乳酸菌，命名為pNZ8149-hLFNZ3900。重組乳酸菌以10ng/mL乳鏈菌肽(Nisin)誘導(dǎo)3小時(shí)后，SDS-PAGE和Western blot分析的結(jié)果顯示，目的蛋白獲得了特異性的表達(dá)；重組乳酸菌超聲破碎后的上清液抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，目的蛋白具有一定的抑制大腸桿菌增殖的活性。
　　 [結(jié)論]
　　 對(duì)所構(gòu)建的重組乳酸菌質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR、雙