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1、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文sBHMT基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化擬南芥研究姓名：張晏萌申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：余愛麗20080605ConstructionofPlantExpressionVectcarryingSsBHMTgeneTransfmationtoArabidopsisthalianaMastercidate：zhangyanmengMaj：BiochemistryMolecularBiolo
2、gySupervis：YuAiliAbstractWiththedevelopmentofgeicengineeringwecantransfersomeproteincodinggeneswhichhaveimptantphysiologicalfunctionsbutdonotexistinplantintoplantsfadjustingdevelepmentofplantimprovingqualityofplantetc.Be
3、tainehomocysteinemethyltransferase(BHMT)whichisamethylmetabolizingenzymeinanimalsmicroganismscancatalyzemethylofbetaineshiftingtohomocysteinefmingdimethylglycinemethionine.Thereisnoreptofitsexpressionaboutplantuntilnow.A
4、ccdingtotheacterofSsBHMTthatcanpromotesynthesisofproteinbyregulatingmethioninemetabolism.Metwassubstrateofadenosinemethionine(SAM)whichisdominatemethyldoninplant.Methylhavebeentakenpartinmetabolizingadjustingofplant.BHMT
5、wastransferredintoplanttoseekfactiontoplant.RNAwasextractedfromfreshpigliver.SsBHMTgenewasamplifiedbyRTPCR.AfterconfirmingthatitssequencewascrectbysequencingprokaryoticexpressionvectpET30aSsBHMTwasconstructedtransferredi
6、ntoE.coliER2566BL21(DE3).Theobjectiveproteinwasinducedpurified.BySDSPAGEelectrophesisanalysisitwasfoundthatthegenewasnotinducedinE.coliBL21(DE3)butmainlyexpressedinthefmofinsolubleinclusionbodyinER2566expressedalittleins
7、upernatant.ThentheconditionsofinducementincludingODvalueofbacilliinductiontemperatureIPTGconcentrationwereoptimized.Theexpressionofobjectiveproteinenhancedthanbefebutstillexpressedmainlyinthefmofinsolubleinclusionbody.Th
8、usinclusionbodydissolvedwithdenaturingagentwaspurtified.BySDSPAGEelectrophesisanalysistherewasaproteinbbetween45KDa66KDawhichsizeisthesameastheexpected.Meanwhiletheeukaryoticexpressionvectp3301SsBHMTcontainingCaMV35Sprom
9、oterwasconstructed.ThisvectwastransferredintoArabidopsisthalianabyflowerdipmethodofAgrobacteriummediated.25strainswerescreenedbysprayingrepeatedly0.5%(vv)herbicide.LeavesDNAof14strainswhichwereedfrom25transgenicstrainswa
10、sextracted.SsBHMTBARgeneof14strainsweretestedbyPCR.TheresultindicatedthatSsBHMThadbeentransferredintoArabidopsisthaliana.SsBHMTgenewasexpressedpurifiedtransferreditsplantexpressionvectintoArabidopsisthalianawhichprovides
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