DHAR基因植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化仙客來研究.pdf

1、抗壞血酸作為一種重要的抗氧化劑，在植物細胞的酶促和非酶促反應(yīng)中都具有重要意義。脫氫抗壞血酸還原酶以谷胱甘肽為底物，催化脫氫抗壞血酸還原為抗壞血酸，在循環(huán)利用抗壞血酸、保護細胞組分抵御氧化損傷中發(fā)揮重要的作用。本研究是在獲得蘋果脫氫抗壞血酸還原酶基因(DHAR)的基礎(chǔ)上構(gòu)建其植物表達載體，并將其轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將DHAR基因?qū)胂煽蛠?，并初步探討了DHAR基因在仙客來中的轉(zhuǎn)化和表達情況，為仙客來抗性品種改

2、良及分子育種奠定基礎(chǔ)。 主要研究結(jié)果如下： 1.構(gòu)建了DHAR基因植物表達雙元載體pCSB-DHAR并將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌。利用DNA重組技術(shù)，將質(zhì)粒pSB166中包含ED35s-Omega-MCS-UTT-TNOS的一段核苷酸序列定向克隆到質(zhì)粒pCAMBIA1303上，經(jīng)酶切、電泳鑒定表明，已成功構(gòu)建了植物中間表達載體pCSB。 雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-DHAR及中間表達載體pCSB，將DHAR基因片段與線

3、性表達載體pCSB進行定向連接，構(gòu)建了DHAR基因的植物表達載體pCSB-DHAR，通過酶切、電泳鑒定表明，DHAR基因已成功構(gòu)建到植物表達質(zhì)粒中，將此克隆命名為pCSB-DHAR。 采用凍融法，將重組質(zhì)粒pCSB-DHAR導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，在含有卡那霉素、鏈霉素和利福平的平板上篩選陽性克隆，至有單菌落出現(xiàn)，提取質(zhì)粒DNA，進行雙酶切和PCR擴增檢測，結(jié)果表明重組質(zhì)粒己導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中。 2.對載體pCS

4、B-DHAR進行Gus基因的瞬時表達檢測，確定其具有較理想的轉(zhuǎn)化效率。 用導(dǎo)入重組質(zhì)粒pCSB．DHAR的農(nóng)桿菌侵染百合葉片后，對其進行2周的Gus基因瞬時表達檢測，結(jié)果表明侵染后7d瞬時表達率可達100％，說明載體具有較理想的轉(zhuǎn)化效率。 3.優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的以仙客來葉片為受體的遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了轉(zhuǎn)DHAR基因仙客來植株。 通過研究DHAR基因轉(zhuǎn)化中影響葉片轉(zhuǎn)化效率的多種因素，確定了各主要影響因素的值。試驗結(jié)