紅葉芥花青素合成途徑結構基因的克隆及表達分析.pdf

1、紅葉根用芥(Brassica juncea var.napiformis)，以下簡稱紅葉芥，是蕓薹屬芥菜種中的一類蔬菜作物，其肉質根主要做腌漬用，國內栽培面積廣，具有重要的經濟價值。葉色獨特的紅葉芥是根用芥菜中較為獨特的品種，其葉片從子葉展開一直呈現(xiàn)出由花青素積累而形成的紫紅色。近年來，隨著對合成色素安全性的研究，很多對人體具有安全隱患的合成色素已不再使用，因此，花青素作為一種安全的天然色素備受關注。類黃酮類化合物是植物次生代謝的重要產

2、物，大多數(shù)植物葉色和花色的呈現(xiàn)都是因為這類化合物的生成而產生?；ㄇ嗨厥侵参矬w內主要的類黃酮類水溶性色素，在模式植物中其生物合成途徑的研究已經較為詳細，在模式植物中該途徑大多數(shù)結構基因和一部分調控基因均已分離。但紅葉芥中花青素的分子調控機理研究還沒有報道，因此對紅葉芥花青素生物合成途徑中結構基因的克隆與表達對于闡明紅葉芥葉色形成機理、利用基因工程進行新品種選育和天然色素的開發(fā)利用具有重要的意義。
　　 本研究以紅葉芥葉片為材料，根

3、據(jù)花青素生物合成途徑中結構基因保守序列設計特異引物和簡并引物，克隆得到PAL、CHS、CHI、DFR、F3'H和ANS等六個結構基因片段，利用實時熒光定量RT-PCR檢測了在環(huán)境脅迫下紅葉芥葉片花青素合成結構基因的轉錄表達情況以及不同葉色根用芥菜中花青素合成結構基因的轉錄表達情況。主要研究結果如下：1、花青素生物合成途徑結構基因的克隆
　　 根據(jù)已經發(fā)布的芥菜花青素合成途徑結構基因保守序列設計了特異引物或簡并引物，從紅葉芥葉片c

4、DNA中克隆得到了兩個基因的全長cDNA：CHI基因(GenbankAccesion：GU230157，包含一個759bp的開放閱讀框)和DFR基因(開放閱讀框長度為1206bp)；利用特異引物克隆得到了PAL(Genbank Accesion：GQ505065)、CHS(Genbank Accesion：GU230158)、F3'H和ANS(Genbank Accesion：GU230160)基因的部分cDNA保守序列。序列分析表明六

5、個結構基因與其他植物的花青素生物合成途徑結構基因具有較高的同源性。系統(tǒng)進化分析表明6個結構基因的系統(tǒng)進化符合植物分類學的分類。2、環(huán)境脅迫下CHI、DFR和ANS基因的表達分析
　　 利用熒光定量RT-PCR方法分析了CHI、DFR和ANS基因在環(huán)境脅迫下(模擬干旱、低溫和光照脅迫)紅葉芥葉片中的表達情況。結果表明：DFR和ANS基因在經過環(huán)境脅迫處理后表達量顯著增加，而CHI基因經過處理后表達量保持在一個較低的水平。CHI基因

6、雖然表達量極低，但在不同脅迫下都有微量表達。其中低溫和光照脅迫下，DFR和ANS基因在處理12小時后表達量開始上升,CHI基因表達量始終較低并無明顯變化；低溫脅迫下DFR和ANS基因在處理48小時后達到最大值，光照脅迫下在處理后96小時達到最大值；模擬干旱脅迫下，DFR和ANS基因表達量均高于CHI基因，但三者表達量都較低。3、根用芥菜CHS、F3'H、DFR和ANS基因的表達分析
　　 利用熒光定量RT-PCR方法分析了CHS