利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控水稻花青素代謝途徑.pdf

1、花青素(anthocyanin)是植物重要的次級代謝產(chǎn)物之一，主要以糖苷的形式存在于植物細(xì)胞中，賦予植物繽紛的色彩，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最強效的自由基清除劑。在植物發(fā)育過程中，花青素類物質(zhì)具有使植物免受紫外輻射、抗病原菌侵染等重要的生理作用；同時，花青素具有很好的營養(yǎng)價值和保健功能，如提高視覺靈敏性、抑制脂質(zhì)過氧化、防止血小板聚集、維持血管正常的通透性、抗腫瘤、抗突變和抗輻射等。
　　經(jīng)過長期的人工馴化，現(xiàn)在的主栽水稻品種以白米為主

2、；在種植的色稻中，花青素大都積累在籽粒的種皮部。由于花青素的物理水溶性，在食用過程中很容易造成營養(yǎng)成份的流失。本論文通過分子生物學(xué)手段將金魚草中調(diào)節(jié)花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子Delila和Rosea基因?qū)胨净蚪M中，希望通過外源基因調(diào)控水稻胚乳中花青素的代謝合成，嘗試改變水稻籽粒中花青素的積累。
　　本研究主要包括以下幾方面內(nèi)容:
　　1)通過基因工程方法將金魚草中調(diào)節(jié)花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子Delila和Rosea分別構(gòu)建了過量

3、表達載體pROK2-Delila，pCAMBIA1300-Rosea，pCAMBIA1300-Rosea-Delila。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別侵染水稻的愈傷組織，經(jīng)過共培養(yǎng)、抗性篩選、預(yù)分化、再分化、生根培養(yǎng)等分別獲得20株，25株和40株轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)分子鑒定表明:其中60株為轉(zhuǎn)基因植株。
　　2)通過RT-PCR分析和Northern Blot雜交表明外源基因已在水稻植株中穩(wěn)定表達；利用半定量RT-PCR的方法選取外源基因表達量

4、較高的轉(zhuǎn)基因株系并分析了花青素合成途徑中關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)基因CHS、F3H、DFR、ANS、UFGT，在開花不同時期的表達水平。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)基因株系中DFR的表達水平較野生型對照有不同程度的提高；由于轉(zhuǎn)基因個體間的差異，不同株系間結(jié)構(gòu)基因也存在表達差異。
　　3)測定了轉(zhuǎn)基因植株葉片中花青素的相對總含量。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株R21-3和RD33-5葉片中花青素總含量較野生型分別提高了8。85％和11.4％，而D17-8比野生型降低了16.

5、2％；利用HPLC方法分析了轉(zhuǎn)基因水稻籽粒中花青素和類黃酮的成份及含量，結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株中花青素和類黃酮的成分及含量沒有明顯變化。
　　4)分別克隆了黑米和野生型植株中的DFR，序列對比發(fā)現(xiàn):野生型水稻的DFR的序列在第二個外顯子中密碼子TCG突變成了終止密碼TAG，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止。鑒于DFR在花青素合成途徑中的重要地位，本實驗構(gòu)建了DFR的過量表達載體。
　　5)克隆了水稻的GluC啟動子，為將來DFR