石榴資源遺傳多樣性及花青素合成相關(guān)基因克隆與表達(dá)分析.pdf

1、石榴(Punica granatum L.)屬石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木,主要分布于陜西臨潼、山東棗莊、安徽懷遠(yuǎn)、四川會理、云南蒙自和新疆葉城。石榴種質(zhì)資源的整理和評價(jià)是當(dāng)前一項(xiàng)非常重要的基礎(chǔ)工作。石榴各個類型主要根據(jù)產(chǎn)地和某些形態(tài)特征進(jìn)行命名,同物異名,同名異物的現(xiàn)象很普遍,為各地石榴種質(zhì)的交流和科研工作帶來很大的不便。分子分類法能從遺傳物質(zhì)DNA水平揭示各個石榴類型之間的親緣關(guān)系,為石榴栽培育種提供理論的依據(jù).花青素作為果實(shí)著色的

2、主要成分,是近年來葡萄、蘋果、草莓等水果研究的熱點(diǎn)之一。研究紅花石榴及其白花芽變的機(jī)理,既能對育種實(shí)踐提供理論指導(dǎo),又具有很高的科學(xué)研究意義.本研究首先以21份石榴資源為材料,用RAPD分析了它們之間的親緣關(guān)系；然后又用SRAP分析了23份石榴資源的親緣關(guān)系,對紅花石榴的白花變異進(jìn)行了鑒定；最后又以紅花石榴母株為材料,克隆了花青素合成相關(guān)基因PgCHS、PgANS、PgUFGT和PgMYB,以及PgActin。對上述基因在紅花母株和白花

3、變異株不同發(fā)育階段組織部位的表達(dá)差異進(jìn)行了分析。進(jìn)一步克隆比較了母株和變異株MYB基因上游調(diào)控序列。現(xiàn)將主要研究結(jié)果介紹如下:
　　 1、以21個石榴資源為試驗(yàn)材料,利用12條RAPD引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,共擴(kuò)增出1267個條帶,其中多態(tài)性條帶436個,多態(tài)率為35％,表明石榴不同類型有豐富的遺傳多樣性.21個石榴資源遺傳距離為0.0909—0.8207。UPGMA聚類結(jié)果表明,21個石榴基因型分為5個類群(A、B、C、D和E)。

4、重瓣花和單瓣花石榴基因型存在明顯不同的遺傳背景.研究發(fā)現(xiàn):來源于棗莊、徐州的大青皮石榴具有不同的基因型。
　　 2、對SRAP-PCR各個影響因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,石榴葉片適宜的SRAP-PCR反應(yīng)體系中,含dNTP0.2 mmol/L,Mg2+2 mmol/L,引物0.4μmol/L,DNA模板0.8 mg/L,Taq酶50000 U/L。采用優(yōu)化的SRAP-PCR反應(yīng)體系,對紅花石榴母株上的白花變異枝進(jìn)行鑒定和分析。

5、r>　　 3、以23個石榴資源為試材,利用7對SRAP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,共擴(kuò)增出1380個條帶,其中多態(tài)性條帶662個,多態(tài)率為48％。應(yīng)用DPS分析軟件構(gòu)建UPGMA聚類圖,23個石榴資源遺傳距離在0.0769～0.4131之間.在遺傳距離0.33處,可將石榴資源分為A、B、C、D和E5個類群。4種單瓣白花類型都聚類在A組；B組都是單瓣紅花、味甜的鮮食品種；C組中鮮食品種果皮都不著色；4種不同花色或葉型的單瓣、賞食兼用類型則聚在D

6、組；觀賞型墨石榴與其它類型顯著不同,單獨(dú)聚為一類(E組)。以上結(jié)果表明,石榴資源有著豐富的遺傳多樣性。
　　 4、用600對SRAP隨機(jī)引物組合對紅花母株和白花芽變DNA進(jìn)行了分析,其中有580對引物組合有較好的擴(kuò)增效果,其中Me30/Em7引物組合在母株和變異株間擴(kuò)增出一條長度為78 bp穩(wěn)定差異條帶。根據(jù)該差異片段序列設(shè)計(jì)的特異引物在母株中有68 bp擴(kuò)增條帶,而在變異株中沒有擴(kuò)增條帶,表明白花變異株DNA序列已經(jīng)發(fā)生了改變

7、。
　　 5、用3種不同RNA提取方法對富含多糖和酚類物質(zhì)石榴果皮RNA提取效果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,改良CTAB法提取的總RNA OD值在1.91左右,得率為48μg/g；Trizol法提取總RNA OD值在1.15左右,得率為86μg、g；試劑盒提取得到的總RNA OD值在1.24左右,得率為124μg/g。分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為RT-PCR模板。根據(jù)8種植物花青素合成關(guān)鍵酶基因CHS基因保守序列設(shè)計(jì)簡并引物進(jìn)行RT-PC

8、R,其中只有改良CTAB法得到的cDNA有擴(kuò)增條帶。而其它2種提取方法得到的cDNAPCR無擴(kuò)增條帶,表明改良CTAB法比較適合石榴果皮總RNA的提取。
　　 6、用簡并引物從紅花石榴cDNA中擴(kuò)增出花青素合成相關(guān)基因PgCHS、PgANS、PgUFGT、PgMYB,用特異引物擴(kuò)增出PgActin。其中PgCHS為432bp,Genebank登錄號為GU982933；PgANS cDNA片段長618bp,Genebank登錄號為

9、GU376749；PgUFGT cDNA片段長1111bp,包括編碼區(qū)1074bp,3’端非翻譯區(qū)37bp,Genebank登錄號為GU371443；PgMYB cDNA片段長576bp,包括編碼區(qū)465bp,3’端非翻譯區(qū)111bp,Genebank登錄號為GU371444.Pgactin cDNA片段長168bp,Genebank登錄號為GU376750.Blast比對結(jié)果表明,上述基因推測氨基酸序列與葡萄、梨等物種有70～80％的

10、序列同源性。以Pgactin為參照基因,分別對紅花母株及其白花芽變不同發(fā)育階段幼葉、花萼、花朵進(jìn)行了半定量表達(dá)分析,結(jié)果表明PgANS基因在母株和芽變中表達(dá)無明顯差異；PgVFGT和PgMYB表達(dá)差異明顯.在母株中PgUFGT、PgMYB有較高的表達(dá)量,而在芽變中表達(dá)量很低或者檢測不到,結(jié)果表明PgUFGT和PgMYB在石榴花青素合成中起著重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 7、以PgMYB序列設(shè)計(jì)引物做Tail PCR,得到MYB5’端上

11、游序列684bp,以此序列和已知cDNA序列分別設(shè)計(jì)特異引物母株和芽變植株cDNA和DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到PgMYB cDNA全長序列PgMYB,序列為570bp,MYB DNA序列全長930bp及其上游啟動子序列543bp,其中MYB DNA全長序列包含有360bp內(nèi)含子序列,登錄號為HM056531。PgMYB cDNA全長序列推測蛋白預(yù)測理論分子量為22.25Kda,預(yù)測理論等電點(diǎn)為7.15.內(nèi)含子剪切位點(diǎn)符合‘GT…AG’