海帶(Saccharina japonica)褐藻膠合成途徑若干基因的克隆、表達以及功能驗證.pdf

1、褐藻膠作為褐藻細胞壁的特征性組分,具有多種生物活性,廣泛應用于食品、醫(yī)藥和紡織等多個行業(yè)。相對假單胞菌屬和固氮菌屬微生物而言,褐藻的褐藻膠生物合成途徑尚不明確,研究其合成通路基因的結(jié)構(gòu)與功能,不僅對于研究褐藻綱的系統(tǒng)進化具有重要的科學意義,同時也將為分子輔助育種、基因工程等研究提供必要的功能基因研究基礎(chǔ)。
　　本論文利用生物信息學方法,對“國際千種植物轉(zhuǎn)錄組計劃”數(shù)據(jù)庫和海帶基因組數(shù)據(jù)庫進行檢索和注釋,對褐藻膠生物膠合成途徑的基因

2、(PMI、PMM、MPG、algD和algG)進行了候選基因的同源性、結(jié)構(gòu)域、三維結(jié)構(gòu)等分析,初步完成了對其基因功能的預測,基本構(gòu)建完成了海帶等的褐藻膠生物合成途徑;通過研究褐藻膠合成途徑基因的拷貝數(shù)變化、多基因家族特殊的基因排布方式以及基因的系統(tǒng)進化關(guān)系等,探討了藻類褐藻膠合成通路基因的進化起源和多基因家族的適應性變異和演化過程。結(jié)果顯示:海帶等褐藻的褐藻膠合成途徑與微生物基本一致,但其第一步反應(可逆性催化甘露糖-6-磷酸和果糖-6

3、-磷酸之間的相互轉(zhuǎn)化)和第三步反應(可逆性催化甘露糖-1-磷酸和GDP-甘露糖之間的相互轉(zhuǎn)化)的酶則由Type I類型雙功能PMI基因(同時具有PMI和MPG活性)編碼;褐藻膠合成通路中前體物質(zhì)GDP-甘露糖醛酸合成基因的拷貝數(shù)較少(海帶中PMI基因為3個拷貝、PMM基因為單拷貝、algD基因為5個拷貝),但是其異構(gòu)化修飾基因(algG)拷貝數(shù)眾多以超大基因家族形式存在(海帶有78個成員),且海帶基因組中多拷貝基因 algG基因的數(shù)目明

4、顯多于長囊水云(海帶中algG基因成員數(shù)是水云algG基因的約三倍)。
　　本論文首次完成了海帶褐藻膠生物合成途徑中關(guān)鍵基因的克隆(Sja-PMM基因和Sja-algG基因),并對比研究了Sja-PMM和Sja-PMI4的酶學性質(zhì)。原核表達后獲得Sja-PMM重組蛋白,大小為48 KDa,濃度為0.97 mg/ml,酶活性檢測顯示其同時具有磷酸甘露糖變位酶(PMM)和磷酸葡萄糖變位酶(PGM)活性,是一個雙功能的底物非特異性蛋白;

5、該蛋白的PMM和PGM活性的最適宜溫度分別為25℃和30℃,最適緩沖液pH分別為7.4和7.0,酸性環(huán)境抑制酶活性,而堿性環(huán)境(緩沖液pH大于9.0)中酶活性幾乎完全喪失;Mg2+和Co2+可極其顯著促進PMM活性和PGM活性,Zn2+抑制PMM活性,其他金屬離子(Ca2+, Cu2+, Cd2+和 Pb2+)則對兩種活性均無顯著影響;重組蛋白Sja-PMM的PMM活性顯著高于其PGM活性,以甘露糖-1-磷酸作為底物,Vmax為58.8

6、2 U/mg,Km為699.41μM,Kcat/Km為0.0672 s-1μM-1,以葡萄糖-1-磷酸為底物,Vmax為6.45 U/mg,Km為41.04μM,Kcat/Km為0.125 s-1μM-1。
　　酶學性質(zhì)檢測結(jié)果顯示,Sja-PMI4重組蛋白屬于Type I類型的雙功能PMI蛋白,相比較其微弱的PMI活性,Sja-PMI4重組蛋白具有顯著的MPG活性,其MPG活性最適反應溫度和pH分別為40℃和7.0。不同金屬離子

7、對MPG活性的促進作用順序為Mn2+>Mg2+>Ca2+>Cu2+,Zn2+顯著性抑制MPG活性;酶促反應動力學參數(shù)分別為Vmax為3.28 U/mg,Km為32.44 mM,Kcat/Km為1.12 s-1mM-1。
　　對藻類褐藻膠途徑同源基因的系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示褐藻中的algD和algG基因可能起源于細菌的基因水平轉(zhuǎn)移,而PMI和PMM基因可能起源于質(zhì)體的二次內(nèi)共生事件;海帶和長囊水云中PMI基因都為3個拷貝,而Sja-P

8、MI4功能驗證結(jié)果顯示,其MPG的功能可能源于基因復制后的新功能進化。褐藻膠合成的差向異構(gòu)修飾基因(algG基因)在海帶和長囊水云等褐藻基因組中存在多拷貝和基因串聯(lián)重復現(xiàn)象,algG基因家族可根據(jù)系統(tǒng)進化結(jié)果大致分為五個類型,其形成可能源于基因復制事件,其多拷貝以及內(nèi)含子分布的差異特征顯示可能存在著不同的調(diào)控方式;algG基因催化甘露糖醛酸向古洛糖醛酸的變構(gòu),能夠提高褐藻膠的強度進而影響到藻體的柔韌程度,與藻類對潮汐、海流等生態(tài)環(huán)境的適