藤茶類黃酮合成相關(guān)基因的克隆與表達分析.pdf

1、藤茶(Ampelopsis grossedentata W.T.Wang)，系葡萄科蛇葡萄屬的藤本植物，其莖葉富含二氫楊梅素(dihydromyricetin，DMY)等黃酮類化合物，可以加工成保健茶，具有清熱解毒、消炎、抗氧化、保肝護肝和增強免疫力等多種功效。
　　本文從藤茶中克隆了5個類黃酮合成相關(guān)基因，并對適于實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)的內(nèi)參基因進行篩選。然后分析了類黃酮合成相關(guān)基因在藤茶葉片不同發(fā)育時期、不同

2、器官組織中的表達水平及其與DMY含量的相關(guān)性，以期為闡明藤茶DMY高含量形成的分子機理提供基礎(chǔ)信息。主要結(jié)果如下：
　　1、檢測了Actin、18s-rRNA、GAPDH、α-tubulin、β-tubulin和UBQ等6個常見管家基因在藤茶中的表達情況，并使用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，當比較不同器官組織的基因表達時，Actin、18s-rRNA和 GAPDH的穩(wěn)定性較好；

3、當比較葉片不同發(fā)育時期的基因表達時，18s-rRNA、GAPDH和α-Tubulin的穩(wěn)定性較好。綜合考慮，本文選取18s-rRNA作為內(nèi)參基因。
　　2、采用同源克隆技術(shù)，從藤茶葉片中克隆了5個類黃酮合成相關(guān)基因：AgPAL、AgC4H、Ag4CL、AgCHS和AgCHI，其開放閱讀框長度分別為2133bp、1518bp、1713bp、1182bp和717bp，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST分析，這5個基因推導的氨基酸序列與葡萄、白

4、樺、金銀花和柑橘等其他物種具有較高的同源性（77％~96%）。
　　3、qRT-RCR結(jié)果表明，在藤茶葉片不同發(fā)育時期，AgPAL、AgC4H、Ag4CL、AgF3H的表達量在前三葉中隨著葉片的成熟度增加而下降，第四葉中表達量上升；AgF3’H的表達量第一葉和第二葉的表達量呈現(xiàn)遞減的狀態(tài)，第三葉和第四葉的表達量呈現(xiàn)增加；AgCHS、AgF3’5’H的表達量均為第一葉最高，第二葉到第四葉的表達量并無明顯變化；而AgCHI、AgDFR

5、和的表達量從第一葉到第四葉沒有明顯變化。對于不同器官，AgPAL和AgDFR在幼根中表達量最高，其次是葉和嫩莖；Ag4CL、AgCHS和AgF3’5’H在幼根和嫩莖中基本不表達，只有在葉片中表達；AgC4H、AgCHI、AgF3H和AgF3’H在葉片中表達量最高，其次是幼根，在嫩莖中表達量最低。
　　4、利用HPLC技術(shù)，測定了藤茶不同時期、不同器官中的DMY含量，結(jié)果表明，在葉片不同發(fā)育時期，DMY含量隨著葉片的成熟度增加而下降

6、，即第一葉＞第二葉＞第三葉＞第四葉。而對于不同組織器官中，DMY在幼根中基本不含有，而在葉中含量最高，嫩莖中含量次之。
　　5、對藤茶葉片不同發(fā)育時期和不同組織器官中的DMY含量與類黃酮合成基因的表達量進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，對于葉片不同發(fā)育時期： AgPAL、AgC4H、Ag4CL、AgCHS、AgF3H、和 AgF3’5’H的基因表達量越高，其 DMY含量越高，與DMY關(guān)系較大；對于不同器官，隨著AgPAL和AgDFR表達量