毛竹木質(zhì)素合成相關(guān)基因的克隆與表達(dá).pdf

1、我國是世界上竹類資源最豐富的國家，毛竹是竹類資源中最主要且應(yīng)用最廣泛的造林、造紙竹種，因具有速生、纖維素含量高等特點，成為優(yōu)良的紙漿原材料。由于其獨特的生物學(xué)特性，傳統(tǒng)育種手段的應(yīng)用受到嚴(yán)重制約。竹材的固有缺陷制約了竹板材加工的高速發(fā)展，竹纖維原料匱乏制約了竹漿造紙業(yè)的規(guī)?；l(fā)展。如何定向改良現(xiàn)有的毛竹材性，培育滿足我國日益增長的工業(yè)化利用所需的多功能、多用途、高性能、高附加值的專用竹材新品種，已成為當(dāng)前竹類植物遺傳育種的首要任務(wù)。因此

2、，利用生物技術(shù)等手段改變木質(zhì)素含量或改變其制漿性能，創(chuàng)造出符合制漿造紙原料特性要求和適用于板材加工的竹材新品種，對于竹林培育和竹材工業(yè)化利用的技術(shù)進(jìn)步具有重要意義。
　　PAL是木質(zhì)素生物合成途徑的核心酶之一，位于苯丙烷代謝途徑的入口；CCoAOMT和CAD是兩種位于木質(zhì)素特異合成途徑下游的酶類，對于木質(zhì)素合成調(diào)控也具有重要作用。本文主要在毛竹木質(zhì)素生物合成酶相關(guān)基因PAL、CCoAOMT和CAD的克隆、表達(dá)鑒定以及其煙草轉(zhuǎn)化等方

3、面展開研究工作，具體研究內(nèi)容如下：
　　（1）本研究利用改良的CTAB法和Trizol法提取毛竹的DNA和RNA，質(zhì)量較好，純度高，可以用作進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。
　?。?）本研究利用Genome walking法克隆得到毛竹PAL基因的DNA序列，長2736 bp，基因含有一個內(nèi)含子和一個預(yù)測的啟動子序列。推測的毛竹PAL基因DNA序列編碼區(qū)編碼712個氨基酸，分子量約為77 KD。與己知的禾本科植物綠竹、水稻的PAL基

4、因氨基酸序列相似性分別達(dá)到95％、94%。
　?。?）本研究利用RT-PCR和RACE法獲得了毛竹PAL基因全長cDNA(命名為PAL1)，全長共2678bp，開放閱讀框架（ORF）2142bp，編碼713個氨基酸，分子量約為77 KD，與禾本科植物水稻、綠竹的PAL基因有90%以上的相似性。組織特異性表達(dá)表明，PAL1在毛竹根、莖、葉和幼苗中都有表達(dá)，但表達(dá)量存在較明顯差異，根中表達(dá)量最高。
　?。?）分別獲得了長度為78

5、7 bp和1019 bp的CCoAOMT和CAD基因片段。編碼區(qū)分別編碼197、282個氨基酸，與水稻、玉米、梯牧草等植物的CCoAOMT、CAD基因均具有90%以上的相似性，GenBank登錄號分別為EF549579、EF549577。
　?。?）構(gòu)建了毛竹PAL1基因的原核表達(dá)載體pET16b-PAL1，在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)后純化出目的蛋白。以L-苯丙氨酸為底物，測定Km值為(0.421±0.023)×10-3mol/