楊樹4CL基因調(diào)控木質(zhì)素生物合成的研究.pdf

1、本文為了探討Ptd4CL3在木質(zhì)素生物合成的作用及其在基因工程育種中的應(yīng)用前景，以我國(guó)楊樹工業(yè)用材林優(yōu)良品種為試材，利用Ptd4CL3基因cDNA開展了基因工程下游研究工作，取得了一些研究結(jié)果。 1.利用雙元載體pBIN19/RT101，將Ptd4CL3的全長(zhǎng)cDNA片段1.6kb，分別反向和正向插入雙元載體pBIN19/RT101的CaMV35S啟動(dòng)子之后，構(gòu)建了該基因的反義和正義表達(dá)載體“pBIN19/RT101-AS4CL

2、”和“pBIN19/RT101-S4CL”，并成功地轉(zhuǎn)入了根癌農(nóng)桿菌GV3101中。 2.以白楊派雜種無(wú)性系“INRA717”(P.tremula×P.albacl.‘INRA717-1-B4’)為參照，選擇我國(guó)楊樹工業(yè)用材林主栽優(yōu)良品種107楊(P.canadensiscl.‘Neva’)、108楊(P.canadensiscl.‘Guariento’)、109楊(P.deltoides×P.albacl.‘Mincio’)、

3、110楊(P.deltoides×P.maximowicziicl.‘Eridano’)和111楊(P.canadensiscl.‘Bellotto’)等5個(gè)品種(黑楊派或派間雜種無(wú)性系)為試材，對(duì)其葉片再生體系進(jìn)行了優(yōu)化，建立了高效的葉盤法農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化程序，并獲得了經(jīng)抗Kan生根篩選的正義和反義4CL基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行參試，以白楊派雜種。 (1)以MS為基本培養(yǎng)基附加不同濃度的6-BA、TDZ和NAA，建立了5個(gè)參試品

4、種的組織培養(yǎng)擴(kuò)繁體系，莖段外植體培養(yǎng)基(MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L)誘導(dǎo)腋芽增殖，生根培養(yǎng)基為[MS(1/2基本鹽)+NAA0.02mg/L+IBA0.02mg/L]。 (2)對(duì)5個(gè)參試品種的葉片再生體系進(jìn)行了優(yōu)化，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+TDZ0.05mg/L)的誘導(dǎo)效果最好，并建立了高效的葉盤法農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化程序，利用農(nóng)桿菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了經(jīng)抗K

5、an(50mg/L)生根篩選的的正義和反義4CL基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植株。 3.利用PCR檢測(cè)初步篩選出了批量轉(zhuǎn)基因植株，在6個(gè)品種上均獲得了正義和反義基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)在溫室培養(yǎng)10個(gè)月的717楊和110楊的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行4CL酶活性和Klason木質(zhì)素分析，與對(duì)照植株相比，轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)部中4CL酶活性降低了10％～50％，木質(zhì)素含量降低10％～40％，且轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)和生長(zhǎng)發(fā)育未見異常。結(jié)果表明，利用反義RNA技術(shù)抑制

6、4CL基因表達(dá)，能有效降低轉(zhuǎn)基因植株4CL酶活性和木質(zhì)素含量，并且正義和反義4CL基因機(jī)構(gòu)的轉(zhuǎn)化均引起了轉(zhuǎn)基因植株的4CL酶活性和木質(zhì)素含量減低，已經(jīng)篩選出了木質(zhì)素含量下降10％以上的717楊和110楊的轉(zhuǎn)基因株系。 4.利用717楊轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株進(jìn)行RT-PCR反轉(zhuǎn)錄分析，正義和反義4CL基因結(jié)構(gòu)的導(dǎo)入，均能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因內(nèi)源4CL基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物減少，4CL基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上受到了抑制，并且反義基因結(jié)構(gòu)比正義基因結(jié)構(gòu)對(duì)基