銀杏GbPAL和GbANS基因的克隆與表達及ALA對類黃酮含量的影響.pdf

1、銀杏葉類黃酮具有重要的藥用價值,提高其含量已成為銀杏研究的熱點與難題。研究表明,采用生理生化途徑調(diào)控銀杏葉類黃酮含量是一種有效的方法；利用植物基因工程技術(shù)提高銀杏葉類黃酮含量也具有良好的前景。然而,銀杏類黃酮生物合成途徑在分子水平上的報道還較少。為深入研究銀杏類黃酮的合成途徑,并為今后利用基因工程技術(shù)提高銀杏類黃酮含量奠定基礎(chǔ),本文首次克隆并研究了銀杏類黃酮合成途徑中的兩個重要的基因,它們分別是苯丙氨酸解氨酶基因(GbPAL)和花色素合

2、成酶基因(GbANS)。針對生理生化途徑,本文研究了5-氨基乙酰丙酸(ALA)處理對銀杏葉片類黃酮含量影響,以期為提高銀杏葉類黃酮含量提供理論依據(jù)。其主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下： (1)銀杏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、性質(zhì)以及表達模式研究。利用RACE技術(shù)從銀杏中克隆獲得一個苯丙氨酸解氨酶基因GbPAL的cDNA和基因組全長(GenBank Accession No.EU071050)。GbPAL基因基因組序列與cDNA序列一樣,無內(nèi)

3、含子。GbPAL基因cDNA全長為2886 bp,含有一個2172 bp的開放閱讀框(ORF),編碼724個氨基酸。蛋白質(zhì)同源比對分析表明,GbPAL與其它植物的PAL蛋白高度同源,且包含苯丙氨酸解氨酶所必需的保守氨基酸位點和保守模式。用同源建模的方法得到GbPAL蛋白的三維模型,這個模型與歐芹PAL(PcPAL)的三維結(jié)構(gòu)高度相似。PAL基因的系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明,GbPAL與裸子植物的PAL具有更近的親緣關(guān)系。Southern b

4、lot結(jié)果表明,GbPAL基因?qū)儆谝粋€多基因家族。實時定量PCR(real-time PCR)分析表明,GbPAL基因在銀杏不同器官中組成型表達,但在莖和葉中的表達相對較高。Real-time PCR分析結(jié)果顯示,GbPAL基因的表達受UV-B、機械損傷、水楊酸和低溫的誘導(dǎo),暗示GbPAL基因參與了銀杏對逆境脅迫的抗性。線性回歸分析結(jié)果表明銀杏葉類黃酮含量與GbPAL基因表達量之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系,表明GbPAL基因可能是銀杏葉類黃酮

5、合成途徑中的關(guān)鍵基因之一。 (2)銀杏花色素合成酶基因的克隆、功能分析及響應(yīng)非生物脅迫的表達模式。利用RACE技術(shù)首次從裸子植物銀杏中克隆得到一個花色素合成酶基因GbANS的cDNA全長(EU600206)和基因組序列(EU600205)。GbANS基因全長cDNA為1441 bp,含有一個1062 bp的ORF,編碼354個氨基酸。蛋白序列多重比對結(jié)果表明,GbANS蛋白與其它植物的ANS蛋白具有很高的相似性,GbANS存在結(jié)

6、合亞鐵離子和酮戊二酸的保守位點。GbANS基因含有三個外顯子和兩個內(nèi)含子。通過基因組步移的方法獲得了GbANS基因的5'側(cè)翼序列,該區(qū)域含有包括TATA盒在內(nèi)的啟動子必需元件,序列預(yù)測表明,這個區(qū)域還含有光、冷、水楊酸、乙烯和脫落酸應(yīng)答等順式作用元件。同源建模產(chǎn)生的GbANS三維結(jié)構(gòu)與功能已知的、擬南芥ANS(AtANS)的三維結(jié)構(gòu)一樣,具有2-ODD酶特征性的扭曲果凍狀結(jié)構(gòu)。類黃酮特異2-ODD酶進化樹分析表明,GbANS與其它植物的

7、ANS具有共同的祖先。Southern blot結(jié)果顯示,GbANS因?qū)儆谝粋€多基因家族。Real-time PCR分析表明,GbANS基因的表達水平在不同器官以及器官不同時期均有差異性,在成熟果中的表達量最高,胚珠和雄蕊,莖和根中未檢測到有表達,花青苷在各器官中的含量顯示了與GbANS基因器官與發(fā)育表達圖譜良好的一致性。real-time PCR分析結(jié)果顯示GbANS基因的表達水平受UV-B、脫落酸、低溫、水楊酸、乙烯以及蔗糖上調(diào),這

8、一結(jié)果與GbANS基因啟動子序列預(yù)測分析的結(jié)果相吻合,表明GbANS因可能參與銀杏對上述逆境脅迫下的抗性。原核表達的重組GbANS蛋白的分子量大小和通過生物信息學(xué)預(yù)測的分子量大小相同。Western blot試驗結(jié)果表明,重組GbANS蛋白的N末端含有6×His標簽,說明GbANS基因編碼的GbANS蛋白可以在大腸桿菌中正確的表達。利用HPLC分析純化的重組GbANS蛋白體外酶活性,結(jié)果表明重組GbANS蛋白具有兩種功能,即(1)催化無

9、色花青素生成花青素,(2)催化二氫槲皮素生成槲皮素。 (3)ALA對銀杏類黃酮含量的影響。以3年生盆栽銀杏實生苗為試材,研究了葉面處理濃度分別為10、100 mg/L的ALA對銀杏葉光合作用、葉綠素含量、可溶性糖含量、類黃酮含量、總多酚含量、花青苷、黃酮合成相關(guān)的酶(PAL、CHS和CHI),活性的影響。結(jié)果表明,在處理后的第4天,相對對照而言,ALA處理的銀杏葉的光合速率顯著提高,ALA的這種促進作用一直穩(wěn)定維持到處理后的第16天。A

10、LA處理能顯著提高銀杏葉的葉綠體和可溶性糖含量,且隨著處理時間的延長增幅加大,但對于葉綠體a/葉綠體b的比值無顯著性差異?？偡?、類黃酮以及花青苷含量在ALA的處理下迅速增加,其增加速率顯著高于對照。ALA處理下PAL、CHS和CHI的活性變化與類黃酮含量的變化趨勢相似,表明ALA可顯著誘導(dǎo)PAL、CHS和CHI的活性。上述處理效果均具有濃度效應(yīng),以100mg/L ALA的效果較佳。鍵詞：銀杏;類黃酮;苯丙氨酸解氨酶;花青素合成酶;基因克