茶樹育性相關(guān)基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、茶樹是一種廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物，由于自交不親和、雜交結(jié)實(shí)率低和品種間雜交結(jié)實(shí)率差異大，導(dǎo)致茶樹遺傳背景復(fù)雜、雜交育種效率低，限制了遺傳學(xué)研究和遺傳改良相關(guān)工作的開展。本研究以茶樹自交不親和機(jī)制為切入點(diǎn)，使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，發(fā)掘茶樹育性相關(guān)基因，對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行克隆，并通過(guò)基因分型、基因表達(dá)和蛋白的原核表達(dá)等手段，研究關(guān)鍵基因在茶樹育性分子機(jī)制中的作用。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.使用熒光顯微鏡觀察自交（‘福鼎大白茶’ב福鼎大白茶’

2、）和異交（‘福鼎大白茶’ב中茶108’）授粉花柱中花粉管的生長(zhǎng)差異。發(fā)現(xiàn)授粉24 h～48 h自交花粉管的生長(zhǎng)速度明顯慢于異交花粉管;授粉72 h，異交和自交花粉管均長(zhǎng)至花柱基部。表明自交花粉管在花柱中的生長(zhǎng)受到了一定程度的抑制，到達(dá)花柱基部的時(shí)間有明顯延遲。
　　2.為了明確自交花粉管生長(zhǎng)受抑的分子機(jī)制，本文使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法研究了茶樹自交(self-pollination，SP)和異交（cross-pollination，C

3、P）授粉24h、48h和72h后花柱中基因表達(dá)的差異。獨(dú)立構(gòu)建6個(gè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)(CP24、CP48、CP72、SP24、SP48和SP72)分別進(jìn)行測(cè)序，共得到了63762個(gè)Unigene。通過(guò)比較SP和CP樣本間的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到大量的差異表達(dá)基因，其中包括Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、植物-病原菌互作和活性氧代謝等過(guò)程相關(guān)的基因，為茶樹育性相關(guān)重要基因的篩選奠定了基礎(chǔ)。然后研究了SP和CP樣本中隨授粉時(shí)間變化的基因表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)花

4、柱對(duì)自花和異花花粉管具有完全不同的響應(yīng)模式，其中83個(gè)參與氧化還原過(guò)程基因的上調(diào)表達(dá)在SP樣本中有明顯的延遲，與自交花粉管生長(zhǎng)受抑的表型一致，推測(cè)這些基因可能直接參與了花粉管生長(zhǎng)的調(diào)控。
　　3.對(duì)自交和異交授粉的茶樹子房進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，拼接得到51200個(gè)Unigene。與根、葉片和花柱的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，篩選到99個(gè)在茶樹子房中特異表達(dá)的基因，這些基因在花粉-雌蕊互作、花粉管引導(dǎo)和雙受精過(guò)程中具有重要功能。使用熒光定量PC

5、R的方法，研究了51個(gè)與IAA、乙烯、ABA和GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)Unigene，在SP和CP授粉子房中的表達(dá)規(guī)律，篩選到6個(gè)表達(dá)規(guī)律具有顯著差異的Unigene，分別為:GID1、SAUR、GH3.6、GH3.1、IAA29和ARF1，這些基因可能在茶樹花粉管-子房互作階段具有重要功能。
　　4.S-RNase基因是配子體型自交不親和機(jī)制(gametophytic self-incompatibility，GSI)中的雌性決定因子。

6、本研究從轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因中，篩選并克隆了一個(gè)CsS-RNase基因(KU852488)，該基因全長(zhǎng)1121 bp，開放閱讀框全長(zhǎng)717bp，編碼283個(gè)氨基酸殘基;該基因主要在花柱中表達(dá);自交授粉花柱中CsS-RNase的上調(diào)表達(dá)明顯早于異交花柱，且授粉24h自交花柱中表達(dá)量顯著高于異交花柱，與自花花粉管受抑時(shí)間一致。檢測(cè)該基因在11個(gè)茶樹品種（系）中的基因型，發(fā)現(xiàn)該基因存在豐富的遺傳多態(tài)性。然后將CsS-RNase定位到了實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建

7、的遺傳圖譜上。對(duì)CsS-RNase基因進(jìn)行原核表達(dá)，成功分離到了目標(biāo)蛋白。使用不同CsS-RNase蛋白濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉，發(fā)現(xiàn)CsS-RNase能夠明顯抑制自花花粉管的生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明CsS-RNase符合GSI植物S-RNase基因的典型特征，認(rèn)為茶樹自交不親和性在分子機(jī)制上受GSI機(jī)制控制。
　　5.從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到14個(gè)具有完整開放閱讀框的鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kina

8、ses，CDPKs)基因。使用熒光定量PCR檢測(cè)CDPKs的組織表達(dá)特異性，發(fā)現(xiàn)5個(gè)CsCDPKs基因在花粉中特異表達(dá)。然后克隆了這5個(gè)CsCDPKs的cDNA全長(zhǎng)序列。同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它們與多個(gè)擬南芥中參與花粉管極性生長(zhǎng)的CDPKs有較高的同源性。5個(gè)CsCDPKs隨著花粉培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，其中CsCPK3、CsCPK4和CsCPK5在花粉培養(yǎng)初始階段便有快速響應(yīng)。進(jìn)一步選擇了CsCPK5設(shè)計(jì)并合成了硫代修飾的反義寡核苷