茶樹ACS、ACO基因克隆與親環(huán)素基因的鑒定及其表達(dá)分析.pdf

1、乙烯是一種重要的植物激素,參與植物整個(gè)生理過(guò)程.ACC合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)和ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid oxidase.ACO)是植物乙烯合成過(guò)程中的重要酶,對(duì)乙烯的合成具有重要的調(diào)控作用,所以這兩個(gè)基因的研究具有理論與實(shí)際意義. 在茶樹新梢cDNA文庫(kù)測(cè)序所獲得的EST基礎(chǔ)上,利

2、用RACE(Rapid Amplification cDNAEnds)、RT-PCR等技術(shù),克隆得到編碼這兩個(gè)酶的全長(zhǎng)基因序列,在NCBI上分別登錄為EF205149、DQ904328.其中ACS長(zhǎng)1579 bp,編碼478個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量約為53.7 KD,等電點(diǎn)8.039:ACO長(zhǎng)1237 bp,編碼320個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)分子量為36.2 KD,等電點(diǎn)5.41.以Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)ACS及ACO

3、都與柿樹中的同類基因同源性最高,親緣關(guān)系最近.這兩個(gè)基因的獲得為以后進(jìn)一步研究其在茶樹抗逆中的作用打下一定的基礎(chǔ). 根據(jù)所得到的茶樹ACS及ACO基因序列設(shè)計(jì)引物,利用β-actin作為陽(yáng)性對(duì)照,取安吉白茶、6/8、杭州大葉、龍井長(zhǎng)葉、藪北、龍井43和福鼎大白茶7個(gè)品種在經(jīng)歷高溫和低溫,以及龍井43在冬天不同時(shí)期樣品逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行RT-PCR分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACS及ACO基因的表達(dá)量與品種的抗逆性強(qiáng)弱有一定程度的相關(guān)性;在不

4、同時(shí)期龍井43樣品中,ACS及ACO基因的表達(dá)也有類似的結(jié)果. 親環(huán)素廣泛存在于多種生物體內(nèi),在植物的發(fā)育和新陳代謝等生理過(guò)程中具有重要作用.通過(guò)對(duì)茶樹新梢cDNA文庫(kù)大量隨機(jī)測(cè)序,獲得了一個(gè)編碼親環(huán)素的全長(zhǎng)基因,在GenBank登錄,登錄號(hào)為DQ904327.茶樹親環(huán)素基因cDNA全長(zhǎng)949 bp,其中開放閱讀框全長(zhǎng)495 bp,編碼蛋白質(zhì)含有164個(gè)氨基酸,分子量約為17.47 kD,等電點(diǎn)約為8.54,它具備5'端非編碼區(qū)

5、的"CAAT"標(biāo)志及3'端非編碼區(qū)的"AATAAA"poly.A加尾信號(hào).其推測(cè)的氨基酸序列經(jīng)與26條其他生物親環(huán)素蛋白氨基酸序列進(jìn)行CL[JSTALW多序列聯(lián)配并以Neighbor-Joining法進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建后,發(fā)現(xiàn)與水稻和小麥的相似性較高,達(dá)到85﹪以上.根據(jù)親環(huán)素基因開放閱讀框序列設(shè)計(jì)引物,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET/Csin-Cyp,并在大腸桿菌BL21(DE3)中成功誘導(dǎo)出了一個(gè)分子量為23 kD的親環(huán)素融合蛋白.這將便于后