蠟梅親環(huán)素基因的克隆與功能初步分析.pdf

1、親環(huán)素(Cyclophilins,CyPs)是親免素(immunophilin)家族的一員,在番茄、玉米、油菜、大白菜、水稻、擬南芥和豆類等植物中已經分離并克隆得到親環(huán)素基因。它作為免疫抑制劑環(huán)孢素A(cyclosporin A,CsA)的受體蛋白與CsA形成CyP-CsA復合物阻斷了T細胞信號傳遞從而產生免疫抑制作用。親環(huán)素具有肽脯氨酰順反異構酶(PPIase)活性,能夠催化蛋白質尤其是富含脯氨酸蛋白質的折疊、裝配和轉運。親環(huán)素在植物

2、中還參與葉綠體的光保護和氧化還原調節(jié),植物的生長發(fā)育,并在植物脅迫應答及抗病原體免疫等方面發(fā)揮重要作用。
　　 本研究從已經構建好的蠟梅花cDNA文庫中克隆得到了一個蠟梅CYP基因,進行序列特征、原核表達以及轉化煙草的分析,具體結果如下:1、蠟梅親環(huán)素基因的克隆以及分子特征分析。
　　 在已構建的蠟梅花cDNA文庫及EST分析的基礎上,隨機克隆測序得到了一個蠟梅親環(huán)素基因,克隆的蠟梅親環(huán)素cDNA全長為927bp,該基

3、因編碼164個氨基酸,理論分子量約18.26KD,命名為CpCYP(GenBank登錄號:DW223084)。該基因編碼的蛋白與大豆、葡萄等氨基酸序列同源性達到90％以上,有9個PPIase活性位點,屬于單結構類親環(huán)素。CpCYP編碼的蛋白二級結構主要由23.17％的α螺旋、43.90％的隨機卷曲以及27.44％的延伸鏈構成。該基因編碼的蛋白無信號肽,不存在跨膜結構,具有良好的親水性,有5個磷酸化位點。
　　 2、CpCYP基因

4、原核表達載體構建以及表達體系優(yōu)化。
　　 設計帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點的引物,進行PCR擴增,通過克隆載體pMD19-T將CpCYP連接到pET-32a并上轉化至大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)進行誘導表達。獲得的重組蛋白以可溶性形式存在。從誘導溫度、IPTG終濃度和誘導表達時間三個方面優(yōu)化表達體系,溫度提高能夠提高可溶性蛋白的表達量,隨著誘導的時間增加,可溶性蛋白的表達量呈遞增趨勢,在4h后表達量基本不再增

5、加。
　　 3、對煙草的遺傳轉化。
　　 設計帶有XbaⅠ和SacⅠ酶切位點的引物,進行PCR擴增,將擴增獲得帶有酶切位點的特異片段與pMD19-T連接,分別用XbaⅠ和SacⅠ雙酶切pMD19-T/CpCYP和表達載體pCAMBIA2301,回收目的片段并連接,獲得重組質粒pCAMBIA2301-CpCYP。利用凍融法,將重組質粒轉化至農桿菌LBA4404。利用葉盤法轉化煙草,獲得具有Km+抗性的煙草植株,通過GUS檢