蠟梅(Chimonanthus praecox)CpCPC基因的克隆及功能初步分析.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子是能與真核基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白。MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，這個(gè)家族的基因有共同的DNA結(jié)合區(qū)域——MYB結(jié)構(gòu)域。根據(jù)包含MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，MYB轉(zhuǎn)錄因子家族可分為三個(gè)亞家族，分別是Single R-MYB，R2R3-MYB，以及R1R2R3-MYB。MYB蛋白主要具有控制植物細(xì)胞的形態(tài)和模式建成，調(diào)控植物類(lèi)黃酮代謝和參與對(duì)植物激素的應(yīng)答等功能。
　　CPC基因?qū)?/p>

2、于Single R-MYB亞類(lèi)?，F(xiàn)有研究主要集中在CPC基因?qū)Ω约氨砥っ男螒B(tài)建成的影響。其中CPC基因在表皮毛發(fā)育過(guò)程中起到負(fù)調(diào)控作用，而在根毛形成過(guò)程中起到正調(diào)控作用。也有研究表明，AtCPC基因也參與了黃酮類(lèi)物質(zhì)的合成過(guò)程。
　　本研究在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的蠟梅花cDNA文庫(kù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行EST分析，并通過(guò)文庫(kù)隨機(jī)克隆測(cè)序，得到了CPC基因的EST序列，進(jìn)一步利用RACE技術(shù)，克隆得到蠟梅CPC基因的全長(zhǎng)cDNA，將其命名

3、為CpCPC。在使用生物信息學(xué)手段對(duì)該基因進(jìn)行序列特征和進(jìn)化分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了植物超表達(dá)載體使其在煙草中表達(dá)，通過(guò)觀察轉(zhuǎn)基因煙草的根毛發(fā)育情況以及黃酮類(lèi)物質(zhì)含量的測(cè)定，來(lái)研究CPC基因?qū)Ωl(fā)育以及黃酮類(lèi)物質(zhì)合成的影響;通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行基因表達(dá)分析，對(duì)該基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析。獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.CpCPC的克隆及分子特征分析:
　　通過(guò)隨機(jī)挑選蠟梅花cDNA文庫(kù)測(cè)序，獲得了大小約為600 bp的E

4、ST序列，然后通過(guò)RACE技術(shù)獲得cDNA全長(zhǎng)。獲得的CpCPC的cDNA全長(zhǎng)為640bp，其中開(kāi)放閱讀框228 bp，編碼75個(gè)氨基酸殘基，以DNA為模板，使用特異引物克隆得到大約1800bp左右的片段，與cDNA序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)該序列含有兩段內(nèi)含子，且均屬于GT-AG型內(nèi)含子。對(duì)蛋白序列進(jìn)行信息學(xué)分析，結(jié)果表明該蛋白沒(méi)有信號(hào)肽，主要以52.63％的隨機(jī)卷曲和46.05％的α-螺旋構(gòu)成，在葉綠體內(nèi)大量存在。該蛋白存在9個(gè)絲氨酸磷酸化位

5、點(diǎn)、2個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。
　　2.CpCPC表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平分析
　　實(shí)時(shí)熒光定量分析表明CpCPC基因在蠟梅的幼嫩葉片中表達(dá)量最高，在根和雄蕊、雌蕊中的表達(dá)量最低。在3輪花器官中的表達(dá)分析表明在外瓣和中瓣中的表達(dá)量較高，雌蕊、雄蕊中表達(dá)量較低?；òl(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析表明該基因在花發(fā)育過(guò)程中盛開(kāi)及衰敗其表達(dá)最高，其他時(shí)期表達(dá)量相對(duì)較低。
　　3.CpCPC基因在煙草中的超表達(dá)
　　構(gòu)建植物超表

6、達(dá)載體pCAMBIA2301g-CpCPC，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法將pCAMBIA2301g-CpCPC轉(zhuǎn)入煙草植株中，通過(guò)抗性篩選、Gus組織化學(xué)染色、PCR擴(kuò)增等方法獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草植株。提取轉(zhuǎn)基因煙草以及野生型煙草葉片中的類(lèi)黃酮進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)比其含量發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中類(lèi)黃酮較野生型有所減少，且與CpCPC基因的表達(dá)量基本呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明CpCPC可能對(duì)類(lèi)黃酮物質(zhì)的合成起到負(fù)調(diào)控的作用。用體式顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基