大白菜pol CMS育性相關(guān)基因的表達(dá)譜分析.pdf

1、大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)是我國(guó)北方種植最廣泛、栽培面積最大的大眾化蔬菜，生產(chǎn)上推廣用品種幾乎都是雜種一代。應(yīng)用雄性不育系生產(chǎn)一代雜交種，與利用自交不親和系相比，既可保證F1的雜交率，又可防止親本流失。因此對(duì)生產(chǎn)和育種都有著極為重要的意義。目前雖然polima CMS（簡(jiǎn)寫為pol CMS）的機(jī)理研究前人已做了許多工作，但用來(lái)揭示細(xì)胞質(zhì)雄性不育發(fā)生的調(diào)控機(jī)理還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，而溫敏反應(yīng)也一直是Pol

2、 CMS一個(gè)難以徹底解決的重要問(wèn)題。本研究首先對(duì)幾個(gè)不育系的不育類型進(jìn)行了鑒定，然后篩選出2個(gè)pol CMS不育系的恢復(fù)系，1個(gè)溫敏不育系，利用基因表達(dá)譜測(cè)序技術(shù)，研究了pol CMS育性轉(zhuǎn)換的差異表達(dá)，對(duì)部分差異表達(dá)基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，獲得4個(gè)與育性恢復(fù)密切相關(guān)的差異表達(dá)基因，對(duì)獲得的PPR蛋白基因進(jìn)行了測(cè)序和同源性比對(duì)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用測(cè)交和分子鑒定相結(jié)合的方法，將4份大白菜不育材料分別確定為po

3、lCMS、Ogura CMS及核不育類型。
　　對(duì)pol CMS不育系92A的特異片段進(jìn)行了測(cè)序，同源性比對(duì)表明，該片段與已公布的orf224基因序列的同源性為99.41％，僅4個(gè)堿基的差異。氨基酸序列比對(duì)表明，氨基酸序列發(fā)生了7個(gè)堿基的變異，同源性為96.88％。。
　　對(duì)Ogura CMS不育系0963-1A的特異片段測(cè)序結(jié)果表明，該序列與已公布的orf138序列同源性為99.52％，只有2個(gè)堿基的差異，氨基酸序列比對(duì)僅

4、有1個(gè)氨基酸的差異，同源性99.28％。
　　2.獲得2份具有育性恢復(fù)基因的材料，篩選幾率為3.51％。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，不育系與恢復(fù)系雜交的F2代育性分離符合一對(duì)基因控制的3∶1的分離比，恢復(fù)基因?qū)Σ挥驗(yàn)橐粚?duì)顯性基因控制的性狀遺傳。
　　3.獲得了1份對(duì)低溫敏感，育性轉(zhuǎn)換較為徹底的不育系。利用篩選到的溫敏不育系，進(jìn)行了溫敏育性轉(zhuǎn)換基因表達(dá)譜分析。在兩處理之間共獲得2124個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因1508個(gè)，下調(diào)表達(dá)基

5、因616個(gè)。
　　通過(guò)GO功能顯著性富集分析，差異表達(dá)基因所處的細(xì)胞位置主要是細(xì)胞的膜系統(tǒng)，如線粒體膜、光合系統(tǒng)膜、細(xì)胞內(nèi)膜等;分子功能方面主要是與水解酶的活性有關(guān)，如酯酶、糖基酶及羧酸酯酶等。參與的生物過(guò)程主要是細(xì)胞壁和細(xì)胞組成的生物大分子的生物合成、組裝和排列或其去組裝過(guò)程。Pathway顯著性富集分析表明，在育性轉(zhuǎn)換過(guò)程中，差異表達(dá)基因參與的代謝途徑主要是糖和脂肪代謝途徑。
　　選取6個(gè)與花發(fā)育密切相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)

6、行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，進(jìn)一步證明獲得的差異表達(dá)基因與育性轉(zhuǎn)換相關(guān)。
　　4.利用篩選到的恢復(fù)系09-399-1與92A雜交獲得的F2代分離群體構(gòu)建cDNA文庫(kù)，進(jìn)行了恢復(fù)基因的基因表達(dá)譜分析。在兩處理之間共獲得2826個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因441個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因2385個(gè)。
　　GO功能顯著性富集分析表明，差異表達(dá)基因顯著富集的細(xì)胞位置為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)胞膜及大分子復(fù)合物等位置，其中

7、細(xì)胞器位置包括線粒體、葉綠體、質(zhì)體等細(xì)胞器。差異表達(dá)基因的分子功能是核糖核酸外切酶的活性，所參與的生物過(guò)程主要是花粉壁的裝配、花粉發(fā)育及在細(xì)胞水平上細(xì)胞組分的組裝。
　　Pathway顯著性富集分析表明，恢復(fù)基因育性轉(zhuǎn)換中主要代謝途徑是核糖體通路、糖代謝通路、與核酸代謝有關(guān)的核苷酸切除修復(fù)通路及RNA降解通路等。
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證獲得的差異表達(dá)基因與育性相關(guān)，選取16個(gè)差異表達(dá)基因，分別對(duì)不育系、保持系、恢復(fù)系、F1以及F2

8、分離群體的花蕾提取RNA，以F2中的不育群體為對(duì)照，進(jìn)行了real-time qPCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，F(xiàn)2代分離群體、不育系、恢復(fù)系和F1的表達(dá)與表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果一致，保持系的表達(dá)與其它所有材料不同，不管是上調(diào)還是下調(diào)表達(dá)基因，與不育群體相比，所有基因在保持系中均表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。
　　根據(jù)差異表達(dá)基因的表達(dá)水平及驗(yàn)證材料的基因型設(shè)定篩選條件，篩選出了4個(gè)與育性恢復(fù)密切相關(guān)的基因。
　　5.從恢復(fù)基因的cDNA文庫(kù)篩選到1個(gè)PPR

9、蛋白基因。PCR驗(yàn)證表明，在不育系、保持系及F2分離的不育株中均檢測(cè)不到該基因，而恢復(fù)系、F1代及F2分離的可育株中皆可檢測(cè)到該基因，表明該P(yáng)PR蛋白基因與育性有關(guān)。進(jìn)一步對(duì)該P(yáng)PR蛋白基因測(cè)序，并進(jìn)行了同源性比對(duì)，結(jié)果表明該基因與已定位的油菜Rfp基因的同源性為99％。
　　6.進(jìn)行了溫敏和恢復(fù)基因育性轉(zhuǎn)換表達(dá)譜的比較。獲得兩者間共有差異表達(dá)基因270個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因136個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因164個(gè)。糖酵解/糖異生作用、光合-