根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化鄂抗棉9號愈傷組織獲得含Chitinase和β-（1，3）-glucanase基因的棉花再生植株.pdf

1、該試驗利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法,將雙價抗真菌基因幾丁質(zhì)酶基因(Chitinase)和β-(1,3)葡聚糖酶基因(Glucanase)導(dǎo)入鄂抗棉9號胚性愈傷組織,結(jié)果表明:1.IBA和KT及無機鹽對鄂抗棉9號下胚軸再生有重要影響.在1.0mg/l IBA和0.5mg/l KT時為最佳配比,在愈傷組織誘導(dǎo)和增殖期間,培養(yǎng)基中分別添加120mgl<'-1>的硫酸鎂和42mgl<'-1>硫酸亞鐵,使愈傷向胚分化方向發(fā)育.在誘導(dǎo)愈傷時NH<

2、,4>NO<,3>不是可缺少的,否則體細胞難以分化再生,但向胚性愈傷轉(zhuǎn)變時,NH<,4><'+>必須撤去,同時補加1900mgl<'-1>的KNO<,3>,KNO<,3>能促使胚的分化;到胚分化生長成苗時,需附加谷氨酰胺和天門冬酰胺,分別為1000 mgl<'-1>和500 mgl<'-1>,可以增加胚分化率和利于胚生長.2.優(yōu)化了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化體系.以鄂抗棉9號愈傷組織為外植體,對轉(zhuǎn)化的幾個重要參數(shù),如預(yù)培養(yǎng)的有

3、無,共培養(yǎng)溫度,乙酰丁香酮的有無,卡那霉素的選擇濃度進行了篩選.結(jié)果表明:預(yù)培養(yǎng)5-10天較沒有預(yù)培養(yǎng)的愈傷表現(xiàn)出更強的轉(zhuǎn)化效率;共培養(yǎng)溫度以19℃為適宜溫度;使用乙酰丁香酮和不使用乙酰丁香酮效果不明顯;卡那霉素的選擇濃度以100 mg/l為宜.3.獲得了60株抗性小苗,隨機選取20株做PCR檢測,有14株檢測結(jié)果為陽性,取6株P(guān)CR陽性植株進行Southern檢測,結(jié)果表明外源基因已經(jīng)整合到棉花基因組中,拷貝數(shù)由1到3個不等.4.對海