農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)hpalxoo基因棉花再生植株建立及轉(zhuǎn)hpalxoo基因棉細(xì)胞組織抗病表型鑒定.pdf

1、棉花黃、枯萎病是危害棉花維管組織的兩種真菌類病害，在全國(guó)棉區(qū)均有分布，它們通過病原真菌堵塞導(dǎo)管、產(chǎn)生毒素等多種形式危害棉株。在棉花生長(zhǎng)前期可造成死苗，中后期引起蕾鈴脫落，導(dǎo)致產(chǎn)量、品質(zhì)嚴(yán)重下降。培育和推廣轉(zhuǎn)基因抗病品種是防治棉花黃、枯萎病簡(jiǎn)單易行且行之有效的方法。 Harpin蛋白是由植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的富含甘氨酸、對(duì)熱穩(wěn)定但對(duì)蛋白酶K敏感的一類蛋白。它在非寄主植物上能夠引起過敏反應(yīng)，而且很可能是植物病原細(xì)菌的一個(gè)重要的致病因子。

2、另外，harpin蛋白還能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生病蟲抗性以及提高作物的產(chǎn)量與品質(zhì)。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)hpalxoo基因棉花再生植株的建立。本實(shí)驗(yàn)以中棉所35號(hào)為轉(zhuǎn)化受體品種，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將來自水稻白葉枯病菌(Xanthomonas.oryzae pv.oryzae)的hpalxoo基因全長(zhǎng)hpalxoo和其缺失片斷CD轉(zhuǎn)化棉花莖尖外植體及下胚軸外植體。通過對(duì)影響組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化的相關(guān)因素的研究，建立起了適宜農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖、下胚軸遺傳轉(zhuǎn)

3、化體系。主要研究結(jié)果如下： 建立了以棉花莖尖為受體的轉(zhuǎn)化體系。通過對(duì)影響轉(zhuǎn)化頻率相關(guān)因子的研究，以及對(duì)頭孢霉素(Cef)抑菌濃度、卡那霉素(Km)篩選濃度、農(nóng)桿菌菌株的比較篩選，獲得了hpalxoo的轉(zhuǎn)化株，PCR擴(kuò)增到了目的基因，證明了棉花莖尖可做為良好的受體材料并且獲得了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖轉(zhuǎn)化體系：未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的帶下胚軸0.5cm的莖尖在OD600=0.3-0.35的根癌農(nóng)桿菌菌液中浸染15-20min，共培養(yǎng)48-56h；

4、選擇培養(yǎng)以500mg/LCef為抑菌濃度，150mg/LKm為最高篩選濃度；兩種菌株比較結(jié)果hpalXOO的侵染轉(zhuǎn)化率高于CD。 采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化胚性愈傷，只要選擇的細(xì)胞分裂狀態(tài)比較適當(dāng)，能獲得大量獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子，且經(jīng)過2～4次篩選便可進(jìn)入分化培養(yǎng)，僅需5～6個(gè)月便可獲得再生植株，大大縮短了棉花轉(zhuǎn)基因周期。本研究依據(jù)此方法進(jìn)行試驗(yàn)，但是沒有獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，其中諸多影響因素如：基因型、植物激素配比、培養(yǎng)基的選擇、Km選擇壓、農(nóng)桿菌

5、濃度等。 轉(zhuǎn)hpalxoo基因棉細(xì)胞組織抗病表型鑒定。本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了已獲得的轉(zhuǎn)hpalxoo基因棉懸浮細(xì)胞抗病性鑒定及棉花黃萎病菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)hpalxoo基因棉花產(chǎn)生微過敏防御反應(yīng)的試驗(yàn)。主要研究結(jié)果如下： 棉花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)可產(chǎn)生基因型相對(duì)一致、快速分裂的細(xì)胞群，且容易加入誘導(dǎo)物質(zhì)，同時(shí)還能使病原菌與寄主互作的過敏反應(yīng)得以簡(jiǎn)化。通過棉花懸浮細(xì)胞與黃、枯萎菌共培養(yǎng)，分別在3h、6h、9h、12h、24h顯微觀察驗(yàn)證了棉花懸浮細(xì)

6、胞的存活率，導(dǎo)入Harpin蛋白的轉(zhuǎn)基因棉花T-33、T-34的抗病性較好，在相同條件下與受體中35(Z35)相比死亡率低近10個(gè)百分點(diǎn)。 利用針刺葉片接菌法，通過已獲得的轉(zhuǎn)編碼Harpinxoo的基因hpalxoo的棉花材料、其出發(fā)品種與棉花黃萎病菌互作，采用細(xì)胞學(xué)染色等方法顯微觀測(cè)棉花葉片組織細(xì)胞是否會(huì)對(duì)棉花黃萎病菌產(chǎn)生microHR等細(xì)胞學(xué)抗病反應(yīng)表型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，導(dǎo)入Harpin蛋白的轉(zhuǎn)基因棉花，氧化帶與傷口間細(xì)胞具有