核苷酸切除修復基因甲基化及其轉錄調控在砷致病機制中作用.pdf

1、研究背景:地方性砷中毒是一種嚴重危害人類健康的疾病，該病不僅引起皮膚、肝臟等多系統(tǒng)、多臟器損害，危害更大的是可導致皮膚癌、肝癌、肺癌和膀胱癌等發(fā)生。地方性砷中毒包括飲水型和燃煤污染型，其中燃煤污染型地方性砷中毒（以下簡稱燃煤型砷中毒）是我國特有病型，僅發(fā)現(xiàn)于我國貴州、陜西兩省。砷對機體作用復雜，其致病或致癌機制不清是砷中毒預防和控制的主要難題。
　　已證實砷暴露可導致DNA、染色體損傷，同時有研究發(fā)現(xiàn)砷可抑制一些DNA修復酶表達，

2、且砷暴露者存在DNA修復缺陷，提示DNA損傷及DNA損傷修復受抑均可能在砷毒作用機制中起重要作用。核苷酸切除修復（NER）系統(tǒng)是修復環(huán)境中理化因素所致DNA損傷的一個重要修復系統(tǒng)，受損DNA的“識別”、“解旋”和“切除”是NER修復過程中的三個限速步驟，控制核苷酸切除修復進程，XPC、XPD和ERCC1蛋白分別參與此三個關鍵環(huán)節(jié)，發(fā)揮識別受損DNA、使受損DNA雙鏈發(fā)生解旋以及切除受損 DNA的作用。有研究表明，核苷酸切除修復基因變異或

3、表達異常與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關，但其機制并不清楚。
　　目前研究認為，除遺傳學外，尚存在表觀遺傳學這一重要的基因表達調控機制。DNA甲基化是最重要的表觀遺傳模式之一，特定基因高甲基化與基因表達沉默密切相關。無機砷在生物體內的甲基化代謝與DNA甲基化過程極為相似，可能存在對甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的競爭，并因此干擾機體DNA甲基化模式。
　　本研究以該省燃煤型砷中毒人群及體外培養(yǎng) HaCaT細胞為研究對象，采用重亞

4、硫酸鹽測序-定量甲基化特異性 PCR法檢測砷中毒患者外周血淋巴細胞、皮膚組織中XPC、XPD基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)及ERCC1基因第2外顯子區(qū)、轉錄起始點－4901~－4671區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)；實時熒光定量PCR法檢測砷中毒患者外周血淋巴細胞中XPC、XPD和ERCC1基因 mRNA表達；免疫組織化學法檢測砷中毒患者皮膚組織中XPC、XPD和ERCC1蛋白表達。采用四噻唑藍法測定亞砷酸鈉處理HaCaT細胞中細胞代謝活力，單細

5、胞凝膠電泳實驗檢測細胞DNA損傷效應；重亞硫酸鹽測序法和重亞硫酸鹽測序-定量甲基化特異性PCR法檢測XPC、XPD基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)及ERCC1基因第2外顯子區(qū)、轉錄起始點－4901~－4671區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)；實時熒光定量PCR法檢測XPC、XPD和ERCC1基因mRNA表達；免疫印跡法檢測XPC、XPD和ERCC1蛋白表達。同時用甲基轉移酶抑制劑5-脫氧雜氮胞苷（5-AZA-dC）對亞砷酸鈉處理HaCaT細胞進行干預

6、，用上述方法分別檢測XPD基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)、XPD基因mRNA及蛋白表達水平。
　　人群研究發(fā)現(xiàn)：砷中毒患者外周血淋巴細胞和皮膚組織中XPD基因啟動子區(qū)、ERCC1基因第2外顯子區(qū)存在高甲基化，且在外周血淋巴細胞和皮膚組織中兩者高甲基化存在一致性；XPD、ERCC1基因mRNA及蛋白表達下降，且蛋白表達下降與其高甲基化有關。體外細胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)：NaAsO2處理細胞XPD基因啟動子區(qū)存在高甲基化，呈劑量-效應關系；X

7、PC和XPD基因mRNA及蛋白表達下降，且XPD基因mRNA及蛋白表達下降與其啟動子區(qū)高甲基化有關。體外干預實驗研究觀察到5-AZA-dC可逆轉NaAsO2所致的XPD基因啟動子區(qū)高甲基化，且上調XPD mRNA和蛋白表達受抑水平。
　　全文結論：
　　1、人群和體外細胞實驗研究發(fā)現(xiàn)，砷通過導致XPD基因高甲基化改變，繼而引起XPD基因mRNA及蛋白表達受抑，其可能通過影響XPD蛋白對受損DNA的解旋，繼發(fā)性抑制DNA修復，

8、促進砷中毒乃至皮膚癌的發(fā)生發(fā)展。
　　2、人群研究發(fā)現(xiàn)：①燃煤砷污染致人體ERCC1基因高甲基化，是引起其mRNA及蛋白表達降低的原因之一，ERCC1蛋白參與受損DNA的“切除”步驟可能是砷毒作用主要環(huán)節(jié)；②砷中毒患者外周血淋巴細胞和皮膚組織中XPD基因啟動子區(qū)、ERCC1基因第2外顯子區(qū)高甲基化存在一致性，為兩者成為監(jiān)測砷中毒發(fā)生發(fā)展的早期生物學標志提供了重要線索。
　　3、體外干預實驗研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化轉移酶抑制劑5