含砷中藥對骨髓增生異常綜合征異?；蚣谆{(diào)控作用研究.pdf

1、第一部分、含砷中藥青黃散為主方案對骨髓增生異常綜合征患者甲基化調(diào)控作用研究
　　目的:檢測MDS患者的甲基化狀態(tài)，分析異常基因甲基化狀態(tài)所涉及的通路，理解異常基因甲基化在MDS病理中的作用;檢測青黃散為主方案治療前后MDS患者甲基化狀態(tài)的改變情況，分析改變的異常甲基化基因所涉及的功能通路，明確青黃散為主方案治療MDS的機(jī)理。
　　方法:采用甲基化基因芯片技術(shù)(Chip-on-chip)檢測治療前15例MDS患者骨髓DNA甲基

2、化狀況，同時檢測28例健康中國漢族人骨髓DNA甲基化，比較MDS患者與正常對照組甲基化的異同;采用自身對照研究方法，觀察經(jīng)青黃散為主方案治療的15例MDS患者前后基因甲基化改變情況，同時以正常對照組28例，分析治療前后MDS異?；蚣谆母淖兦闆r。差異甲基化基因通過采用Fisher精確檢驗(yàn)和x2檢驗(yàn)獲取。異常的差異甲基化基因采用采用Go-analysis及Pathway-analysis方法進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1.

3、MDS患者的異常高甲基化和低甲基化基因:與正常對照組比較，MDS患者存在7724個異常高甲基化基因，同時有32個低甲基化基因?；贕o與Pathway數(shù)據(jù)庫，我們對正常對照組與治療前MDS基因甲基化水平比達(dá)1.4倍以上的基因進(jìn)行分析，Go分析發(fā)現(xiàn)，MDS患者涉及554個高甲基化基因，這些高甲基因共參與237類不同的生物學(xué)功能和通路，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、細(xì)胞循環(huán)負(fù)調(diào)控、細(xì)胞循環(huán)捕獲調(diào)控、Wnt受體信號通路、Toll樣受體信號

4、通路、凋亡信號通路、BMP信號通路等。涉及了25個低甲基化基因，這些低甲基化基因共參與75類不同的生物學(xué)功能和通路，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖正調(diào)控、B細(xì)胞分化正調(diào)控、免疫相關(guān)的白細(xì)胞激活、Wnt信號通路、對Wnt信號通路監(jiān)管的調(diào)控等。Pathway分析發(fā)現(xiàn)，MDS患者共有185個高甲基化基因，這些高甲基因共參與35個不同的生物學(xué)通路，包括腫瘤通路、Wnt受體信號通路、DNA復(fù)制、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等。共涉及了2個低

5、甲基化基因，參與1個生物學(xué)通路。
　　2.含砷中藥青黃散為主方案對MDS基因甲基化的作用
　　2.1 15例MDS患者經(jīng)含砷中藥青黃散為主方案治療前后的甲基化狀態(tài)改變:相對于治療前MDS患者，經(jīng)治療有11311個基因的甲基化水平下降，57個基因的甲基化水平上升。對治療前后達(dá)1.5倍以上變化的高甲基化和低甲基化基因進(jìn)行Go與KEGG數(shù)據(jù)庫分析，Go分析共發(fā)現(xiàn)了1895個低甲基化基因，這些低甲基因共參與640類不同的生物學(xué)功能和

6、通路，包括細(xì)胞循環(huán)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、凋亡及細(xì)胞表面受體信號通路、Wnt受體信號通路、BMP信號通路、toll樣受體信號通路、Notch信號正調(diào)控等。發(fā)現(xiàn)了13個高甲基化基因，這些高甲基化基因共參與49類不同的生物學(xué)功能和通路，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控、上皮細(xì)胞調(diào)節(jié)、UTP與CTP生物合成等。Pathway分析共涉及了861個低甲基化基因，這些低甲基因共參與125類不同的生物學(xué)功能和通路，包括癌癥通路、MAPK信號通路、P23/AKT信號通路

7、、NF-KB信號通路、Wnt信號通路、Toll樣信號通路、P53信號通路等。發(fā)現(xiàn)了了2個上調(diào)甲基化基因，這2個高甲基化基因共參與2類不同的通路即嘌呤與嘧啶代謝通路。
　　2.2 與正常對照相比，青黃散為主治療方案對MDS甲基化作用與正常對照相比，青黃散方案治療后高甲基化基因數(shù)由治療前的7724降為3467，低甲基化基因由治療前的32個提高至107個。對治療前后達(dá)1.4倍以上變化的高甲基化和低甲基化基因進(jìn)行GO與Pathway分析，

8、與正常對照相比，進(jìn)行GO分析的基因由治療前的579個（高甲基化基因554個，低價甲基化基因25個）降為117個，低甲基化基因消失;進(jìn)行Pathway分析的基因由治療前的187（高甲基化基因185個，低價甲基化基因2個）降為30個，2個低甲基化甲基化基因消失。結(jié)合GO分析，經(jīng)過青黃散為主方案治療后，涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、細(xì)胞循環(huán)負(fù)調(diào)控、細(xì)胞循環(huán)捕獲調(diào)控、Wnt受體信號通路、Toll樣受體信號通路、凋亡信號通路、BMP信號通路等

9、功能與通路的異常甲基化基因已消失。通過Pathway我們也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過青黃散為主方案治療后，涉及腫瘤通路、Wnt受體信號通路、DNA復(fù)制、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路的異常甲基化基因均已消失。
　　結(jié)論:MDS患者具有大量異常的高甲基化基因，同時還有部分異常的低甲基化基因，通過GO與Pathway分析得出這些異常的高甲基化基因與低甲基化基因涉及多個腫瘤相關(guān)通路，是MDS發(fā)病的重要病理基礎(chǔ);含砷中藥青黃散為主方案治療MDS

10、的機(jī)理在于對MDS異常高甲基化及低甲基化的雙重調(diào)控作用，即以去甲基化為主，促甲基化為輔。
　　第二部分、雄黃主要成分AS2S2對MDS來源細(xì)胞株F-36P的甲基化作用及機(jī)理研究
　　目的:檢測AS2S2處理后MDS來源細(xì)胞株F-36P細(xì)胞DNA甲基化的改變，探討AS2S2對MDS來源細(xì)胞株F-36P的甲基化作用;檢測AS2S2處理后DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(T1，3A，3B)的表達(dá)變化，探討AS2S2對F-36P細(xì)胞甲基化作用的機(jī)

11、制。
　　方法:運(yùn)用DNA甲基化定量試劑盒觀察AS2S2對F-36P全基因組甲基化總體水平的作用;通過人類甲基化450K芯片技術(shù)觀察經(jīng)AS2S2處理的F-36P中具體基因的甲基化狀態(tài)變化;運(yùn)用定量PCR技術(shù)(RT-PCR)研究AS2S2對F-36P中高甲基化基因(BAK1)和低甲基化基因(FOLH1)表達(dá)的影響研究;運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTS)的表達(dá)變化，探討調(diào)節(jié)甲基化的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:

12、r>　　1.AS2S2能夠降低F-36P和HL-60細(xì)胞全基因組的甲基化水平以1μmol和2μmol的AS2S2處理F-36P細(xì)胞72小時后，該細(xì)胞的甲基化水平明顯下降;對于HL-60細(xì)胞，0.4μmol的AS2S2不能降低甲基化水平，2μmol和10μmol的AS2S2處理72小時后能降低該細(xì)胞株的基因組甲基化水平。
　　2.AS2S2誘導(dǎo)F-36P細(xì)胞DNA雙重甲基化:去甲基化與升甲基化在所分析的475，376個CpG位點(diǎn)中，

13、2μmol AS2S2能夠?qū)е翭-36P細(xì)胞基因甲基化水平的明顯變化，其中有19，832個位點(diǎn)(4.17％)的甲基化水平發(fā)生了顯著的改變。在這19，832個位點(diǎn)中，共有7412(37.37％)個位點(diǎn)發(fā)生了高甲基化事件，有12，420(62.36％)位點(diǎn)發(fā)生了低甲基化事件。4μmol AS2S2處理的F-36P細(xì)胞也出現(xiàn)了相似的結(jié)果:即共有21737個(4.57％) CpG位點(diǎn)甲基化水平發(fā)生了改變，其中8704個位點(diǎn)甲基化水平升高，13，

14、033個位點(diǎn)甲基化水平下降。這些DNA甲基化改變時間和相關(guān)的RNA類型沒有特別的相關(guān)性:即所有高甲基化和低甲基化位點(diǎn)都包括了mRNA，ncRNA和非編碼RNA相關(guān)的CpG點(diǎn)。4μmol AS2S2和2μmol AS2S2都能降低或升高F-36細(xì)胞啟動子區(qū)域不同CpG點(diǎn)甲基化水平，在CpG島也見到了同樣的情況:即4μmol AS2S2和2μmol AS2S2都能降低或升高F-36細(xì)胞CpG島區(qū)域不同CpG點(diǎn)的甲基化水平。
　　3.A

15、S2S2對低甲基化(BAK1)和高甲基化基因(FOLH1) mRNA表達(dá)的影響通過RT-PCR觀察了低甲基化基因BAK1和高甲基化基因FOLH1的mRNA表達(dá)水平。4μmol AS2S272小時的處理能夠顯著增加BAK1的表達(dá)水平;對于高甲基化基因FOLH1，2μmol的AS2S2能夠顯著減少FOLH1的表達(dá)水平。
　　4.AS2S2對F-36P，HL-60和K562細(xì)胞DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(1，3a，3b)表達(dá)研究AS2S2處理后

16、，DNMT1在F-36P，HL-60和K562中的表達(dá)沒有顯著變化;對于DNMT3a，AS2S2處理后其在F-36P，HL-60和K562中的表達(dá)水平明顯上升;DNMT3b在F-36P和K562細(xì)胞中表達(dá)沒有顯著變化，但是10μmol AS2S2能夠增加該基因在HL-60中的表達(dá)。
　　結(jié)論:AS2S2對于F-36P細(xì)胞具有雙重的甲基化作用:能夠降低該細(xì)胞的全基因組甲基化水平，同時又能同時誘導(dǎo)高甲基化和低甲基化。而其機(jī)制可能在于通