骨髓增生異常綜合征異常造血克隆相關(guān)分子標志的研究.pdf

1、目的：
　　從免疫表型、分子生物學等方面尋找與骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic Syndromes，MDS)異常造血克隆相關(guān)分子標志，并研究該分子標志在MDS中的作用及其臨床意義。
　　方法：
　　研究對象為天津醫(yī)科大學總醫(yī)院自2010年3月至2012年3月新診斷的MDS患者63例、急性髓系白血病(AML)13例及正常對照40名。第一部分采用流式細胞術(shù)(FCM)檢測白介素-3受體α(CD123)和粘附

2、因子CD96在MDS患者骨髓中的表達情況，從免疫表型方面尋找MDS異常造血克隆的分子標志，并檢測CD96陽性細胞的異常特征。第二部分采用半定量RT-PCR的方法檢測TET2(TET癌基因家族成員2)基因在MDS患者骨髓中的表達情況，并分析其臨床意義，從分子生物學角度探尋惡性克隆的分子標志。采用熒光定量PCR的方法檢測TET2和DLK1(delta like1)基因在MDS患者骨髓中CD3+和CD34+細胞中的表達情況，并分析其臨床意義。

3、第三部分體外培養(yǎng)正常對照骨髓CD34+細胞，采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)敲低TET2的表達；應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測評價細胞增殖和凋亡等生物學特征變化，以探討其在MDS中的作用。第四部分體外培養(yǎng)MDS患者骨髓CD34+CD38-細胞，采用RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)敲低DLK1的表達；應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測評價細胞增殖和凋亡等生物學特征變化，進一步明確該分子標志在MDS異常造血克隆

4、中的作用。
　　結(jié)果：
　　第一部分 MDS患者CD34+CD38-細胞占CD34+的比例為(22.72±23.91)％，顯著高于正常對照組(8.63±9.35)％(P<0.01)，低于AML組(25.15±22.70)％；MDS患者骨髓CD34+CD38-細胞中CD96+及CD123+細胞比例(21.18±24.06，31.62±28.42)％顯著高于正常對照組(11.23±17.91，9.29±12.63)％(P<0.0

5、1)。高危MDS組CD34+CD38-細胞中CD96+及CD123+細胞比例(26.25±27.64，37.56±31.01)％顯著高于低危組(11.44±10.88，15.53±10.96)(P<0.05)；CD34+CD38-CD96+細胞中CD114(7.23±10.25％)，CD110(0.52±1.23％)及AnnexinV(2.96±3.84％)表達率均明顯低于其在CD34+CD38-CD96-細胞中表達率(24.35±21

6、.74％，12.03±10.91％，13.69±17.98％，P<0.05)。
　　第二部分 MDS患者BMMNC中TET2 mRNA表達明顯低于正常對照(P<0.05)，MDS各亞組TET2 mRNA表達無差異。MDS患者TET2 mRNA表達≥0.9者原始細胞比例(1.04%±1.68％)明顯低于<0.9者(6.13％±8.17％，P<0.05)。以骨髓異常染色體核型細胞數(shù)目占總分裂像細胞數(shù)目的比值作為MDS患者惡性克隆負荷，

7、TET2基因的相對表達量隨惡性克隆負荷增高而降低(r=-0.398，P<0.05)；并隨IPSS指數(shù)的增高而降低(r=-0.480，P<0.05)。
　　MDS患者骨髓CD3+T細胞中TET2 mRNA表達是正常對照組的(0.16±0.15)倍(P<0.001)；TET2 mRNA表達水平與血清補體C3呈顯著正相關(guān)(r=0.404，P<0.05)；MDS患者骨髓CD3+T細胞中DLK1 mRNA表達是正常對照組的(1.61±0.8

8、8)倍(P<0.05)；依據(jù)染色體分組，染色體異常組DLK1表達水平是染色體正常組的(1.45±0.44)倍(P<0.05)；DLK1 mRNA表達水平與骨髓原始細胞比例呈顯著正相關(guān)(r=0.343，P<0.05)。MDS患者骨髓CD34+細胞中TET2mRNA表達顯著低于正常對照組[(0.58±0.26)vs(1.25±0.94)](P<0.005)；MDS患者骨髓CD34+細胞中DLK1 mRNA表達顯著高于正常對照組[(2.72±

9、1.02)vs(1.31±1.00)](P<0.001)。
　　第三部分正常人骨髓CD34+細胞轉(zhuǎn)染siRNA靶向TET2后，TET2被敲低，其mRNA表達及蛋白表達水平下降；20例正常對照者CD34+細胞對照組和siRNA-scr轉(zhuǎn)染組細胞G0/G1期分別(93.60±5.54)％和(92.65±7.06)％，S期分別為(5.95±5.53)％和(6.92±7.04)％；G2/M期分別為(0.53±1.07)％和(0.30±0.

10、42)％；siRNA-TET2轉(zhuǎn)染組細胞G0/G1期為(90.82±8.25)％，S期細胞增加為(8.50±8.31)％，G2/M期為(0.47±0.89)％，G0/G1期和S期比例與對照組差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.005)。siRNA-TET2轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率較CD34+細胞對照組和siRNA-scr轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率顯著降低[(23.28±9.73)％vs(26.20±9.78)％vs(26.17±9.88)％](P<0.05)。<

11、br>　　第四部分 MDS患者骨髓CD34+CD38-細胞轉(zhuǎn)染siRNA靶向DLK1后，DLK1被敲低，其mRNA表達及蛋白表達水平下降；23例MDS患者骨髓CD34+CD38-細胞對照組和siRNA-scr轉(zhuǎn)染組細胞G0/G1期分別(91.22±10.82)％和(91.29±10.39)％，S期分別為(8.38±10.65)％和(8.41±10.33)％；G2/M期分別為(0.40±0.55)％和(0.34±0.49)％；siRNA-

12、DLK1轉(zhuǎn)染組細胞G0/G1期為(95.81±3.87)％，S期細胞降低為(3.90±3.61)％，G2/M期為(0.29±0.46)％，G0/G1期和S期比例與對照組差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。siRNA-DLK1轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率較CD34+CD38-細胞對照組和siRNA-scr轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率顯著增加[(38.97±14.32)％vs(32.94±12.64)％vs(33.48±12.44)％](P<0.001)。

13、　　結(jié)論：
　　(1)MDS患者骨髓中CD34+CD38-CD96+細胞與CD34+CD38-CD123+細胞增高，這些細胞存在分化異常、凋亡逃逸等惡性特征，且與骨髓原始細胞比例呈正相關(guān)。
　　(2)TET2基因在MDS患者骨髓單個核細胞、CD3+T細胞及CD34+細胞中表達減低，提示TET2基因可能是MDS的“保護基因”，其表達水平可作為評價MDS患者病情的輔助指標；MDS患者骨髓CD3+T細胞及CD34+細胞中DLK1m

14、RNA表達增高，提示DLK1基因在MDS發(fā)生發(fā)展過程中起到一定作用。同時MDS患者骨髓CD3+T細胞TET2及DLK1基因的表達異常，提示CD3+T細胞有“質(zhì)”的異常，這可能是導(dǎo)致機體免疫監(jiān)視功能下降的機制之一。
　　(3)敲低TET2后，正常人骨髓CD34+細胞凋亡率降低，細胞周期S期增加，具有惡性變的傾向，由此推測TET2表達不足是導(dǎo)致髓系惡性腫瘤形成的機制之一。
　　(4)敲低DLK1后，MDS患者骨髓CD34+CD3