BLU基因在胃癌中的表達(dá)及其甲基化調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:腫瘤抑制基因BLU的表觀遺傳學(xué)沉默與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，然而，BLU在胃癌中的表達(dá)及其生物學(xué)功能尚無相關(guān)報(bào)道。本研究旨在初步探討B(tài)LU基因在胃癌中的表達(dá)變化及其甲基化調(diào)控機(jī)制。
　　方法:（
　　1）用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)法檢測52例胃癌組織及對應(yīng)的癌旁組織、6株胃癌細(xì)胞（SGC7901, HGC27, BGC823, MKN45, MGC803,AGS）及胃黏膜正常上皮細(xì)胞GES-1中BLU mR

2、NA表達(dá)水平,Western blot法檢測7株細(xì)胞中BLU蛋白表達(dá)水平；
　　（2）采用Promoter Scan program軟件預(yù)測BLU核心啟動(dòng)子區(qū)，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，采用TFSEARCH和Methyl Primer Express Software v1.0軟件預(yù)測BLU核心啟動(dòng)子區(qū)中可能有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的功能性CpG位點(diǎn)；
　?。?）重亞硫酸鹽測序PCR（BSP）法分析胃癌細(xì)胞和組織中BLU核

3、心啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化程度，初步分析 DNA甲基化和 BLU基因表達(dá)的關(guān)系，找出潛在的功能性CpG位點(diǎn)；
　?。?）去甲基化藥物處理AGS和SGC7901細(xì)胞，qRT-PCR和Western blot法分析處理后BLU表達(dá)變化；
　?。?）siRNA干擾Sp1表達(dá)及雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，分析BLU表達(dá)是否受轉(zhuǎn)錄因子Sp1調(diào)控；
　?。?）在AGS和SGC7901細(xì)胞中，通過染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）方法分析Sp1

4、能否與BLU啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，采用電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析SGC7901細(xì)胞中BLU-39CpG位點(diǎn)甲基化對Sp1結(jié)合能力的影響；
　?。?）通過CCK-8實(shí)驗(yàn)及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)，研究BLU表達(dá)下調(diào)對胃癌細(xì)胞SGC7901增殖能力及克隆形成能力的影響。
　　結(jié)果:
　　（1）6株胃癌細(xì)胞中 BLU表達(dá)水平均顯著低于胃黏膜正常上皮細(xì)胞株GES-1，69.2％(36/52)的胃癌組織中BLU mR

5、NA表達(dá)明顯低于對應(yīng)癌旁組織，且胃癌組織臨床病理特征均與 BLU表達(dá)之間無顯著相關(guān)性；
　?。?）BLU基因核心啟動(dòng)子區(qū)位于-181~+63bp，軟件預(yù)測出-85CpG和-39CpG是潛在的功能性CpG位點(diǎn)；
　　（3）胃癌細(xì)胞和組織中BLU表達(dá)水平與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平（尤其是-39CpG位點(diǎn)的甲基化）負(fù)相關(guān)，提示-39CpG是潛在的功能性CpG位點(diǎn)；
　　（4）去甲基化藥物處理AGS和SGC7901細(xì)胞后，BLU表

6、達(dá)出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)；
　?。?）BLU轉(zhuǎn)錄受轉(zhuǎn)錄因子Sp1的激活；
　?。?）Sp1結(jié)合于BLU近端啟動(dòng)子區(qū)(-43~35bp)，且其結(jié)合位點(diǎn)“GC box”中-39CpG位點(diǎn)的甲基化可降低其結(jié)合能力，進(jìn)而阻礙BLU基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)；（7）通過siRNA干擾BLU的表達(dá)之后，SGC7901細(xì)胞的增殖能力和平板克隆形成能力顯著提高。
　　結(jié)論:
　?。?）BLU基因在胃癌中的失活與其核心啟動(dòng)子（尤其是-39CpG