S100A4基因DNA甲基化在喉癌中的作用及調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是頭頸部常見的惡性腫瘤之一。在我國,東北地區(qū)是喉癌的高發(fā)區(qū)。過去的10年中,我國喉癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢。喉癌對放療及化療均不敏感,手術(shù)是目前治療的主要手段,但手術(shù)會給患者造成不同程度的損傷。此外,在診斷和治療過程中普遍存在的一個(gè)問題是:除聲門型喉癌外,其他類型喉癌的發(fā)病比較隱蔽,一旦確診,患者往往多已進(jìn)入中、晚期。因此對喉癌進(jìn)行早期診斷,并在

2、基因水平尋求新的治療手段成為當(dāng)前急需解決的問題。
　　 惡性腫瘤被認(rèn)為是一種遺傳和表觀遺傳性疾病。基因在疾病發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制中扮演非常重要的作用,基因序列改變可以導(dǎo)致相應(yīng)基因的表達(dá)異常進(jìn)而導(dǎo)致表型的變化。不僅如此,基因的表達(dá)還受表觀遺傳的控制。近年來,表觀遺傳學(xué)研究己成為基因表達(dá)調(diào)控的研究熱點(diǎn)之一。表觀遺傳調(diào)控機(jī)制包括DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA干擾等,而DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究最深入、最重要的一種機(jī)制,與許多疾病如

3、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。由于DNA甲基化是一個(gè)可逆的修飾過程,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑如氮雜脫氧胞苷(5-Aza-CdR)通過抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶活性,改變腫瘤基因的甲基化狀態(tài),從而使基因的功能得到恢復(fù)或增強(qiáng),進(jìn)而達(dá)到腫瘤治療的目的。前期我們應(yīng)用二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)以及豐富的生物信息資源研究喉癌5-Aza-CdR相關(guān)的蛋白表達(dá)譜,對5-Aza-CdR相關(guān)的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100A4是差異表達(dá)顯著的蛋白質(zhì)之一,提示

4、S100A4基因可能是喉癌發(fā)生過程中的一個(gè)重要基因。人類S100A4基因定位于1q21,編碼由101個(gè)氨基酸組成的多肽,分子量約為11.7kDa。S100A4具有廣泛的細(xì)胞內(nèi)外功能,如影響細(xì)胞骨架形成、改變細(xì)胞形狀、參與信號傳導(dǎo)等。S100A4表達(dá)升高與食管癌、胃癌、結(jié)腸癌及黑色素瘤等的發(fā)生有關(guān),但S100A4參與腫瘤發(fā)生的機(jī)制仍不十分清楚,迄今未見其與喉癌發(fā)生的相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在探討S100A4基因在喉癌發(fā)生中的作用及可能的分子

5、機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 以臨床喉癌標(biāo)本和喉癌Hep2細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)材料,應(yīng)用RT-PCR和WesternBlot檢測喉癌組織中S100A4基因的表達(dá)情況。應(yīng)用MSP方法檢測喉癌組織中S100A4基因DNA甲基化情況。針對S100A4基因設(shè)計(jì)siRNA,體外轉(zhuǎn)錄合成S100A4-siRNA,利用TransMessenger轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)染喉癌細(xì)胞系Hep2,通過RT-PCR和Western Blot檢測轉(zhuǎn)染前后喉癌

6、Hep2細(xì)胞中S100A4基因表達(dá)水平以評價(jià)轉(zhuǎn)染效率；應(yīng)用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell和RT-PCR以及Western Blot分別檢測干擾S100A4基因表達(dá)對Hep2細(xì)胞生物學(xué)特性的影響；針對啟動子區(qū)甲基化位點(diǎn),構(gòu)建S100A4野生型及突變型熒光報(bào)告素酶表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞,檢測這些甲基化位點(diǎn)對S100A4基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用。利用生物信息學(xué)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件預(yù)測可能與S100A4基因上游啟動子區(qū)特異序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,

7、并用EMSA、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)結(jié)合PCR技術(shù)對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證以評價(jià)S100A4啟動子區(qū)特異甲基化序列與相關(guān)反式作用元件的結(jié)合能力。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,人喉癌組織以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中S100A4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于癌旁對照組織；
　　 2.MSP結(jié)果表明,在人喉癌組織中S100A4基因啟動子以及第一內(nèi)含子存在低甲基化,且與S100A4基因表達(dá)上調(diào)相關(guān)

8、；
　　 3.S100A4-siRNA對喉癌細(xì)胞中S100A4 mRNA和蛋白表達(dá)的影響:S100A4-siRNA轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞第5天,S100A4 mRNA表達(dá)水平在S100A4-siRNA組較對照組顯著降低。S100A4-siRNA轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞第7天,S100A4.蛋白表達(dá)水平在S100A4-siRNA組較對照組顯著降低,表明S100A4表達(dá)受到抑制；
　　 4.S100A4-siRNA對人喉癌Hep2細(xì)胞生物

9、學(xué)行為的影響:與對照組相比,在S100A4-siRNA組,喉癌Hep2細(xì)胞的增殖能力和侵襲力顯著降低、凋亡率顯著升高；
　　 5.S100A4調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果:經(jīng)P-MATCH軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)在S100A4存在轉(zhuǎn)錄因子c-Myb、c/Ebp、AP2和MSX-1的結(jié)合位點(diǎn)；
　　 6.熒光素酶結(jié)果顯示S100A4調(diào)控區(qū)甲基化變化對基因活性起調(diào)控作用；
　　 7.EMSA結(jié)果顯示在體外c-Myb和c/Eb

10、p可以S100A4特異性甲基化序列結(jié)合,而MSX-1和AP2不能與S100A4特異性結(jié)合；
　　 8.染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合PCR技術(shù)檢測結(jié)果證明在體內(nèi)c-Myb和c/Ebp與S100A4調(diào)控區(qū)特異性結(jié)合。
　　 結(jié)論：
　　 1.S100A4基因在喉癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)上調(diào),其參與喉癌的發(fā)生和發(fā)展；
　　 2.喉鱗癌中S100A4表達(dá)上調(diào)因?yàn)橹粸镾100A4基因啟動子和第一內(nèi)含子區(qū)低甲基化；