喉癌中S100A8基因調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、喉癌是頭頸部常見(jiàn)腫瘤之一，其發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，越來(lái)越多資料支持炎癥是腫瘤形成及進(jìn)展的重要病因之一，我們的臨床資料同樣顯示喉癌患者通常具有慢性炎癥病史。在前期工作中，我室充分利用東北地區(qū)的病源優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用比較基因組雜交(CGH)和cDNA芯片結(jié)合RT-PCR、Western blot、免疫組織化學(xué)染色等實(shí)驗(yàn)技術(shù)證明炎癥因子S100A8在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的表達(dá)存在顯著地差異性，提示可能存在S100A8基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的異常。microRN

2、A是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類大小為18～23nt的小非編碼轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)約70～90個(gè)堿基的單鏈miRNA前體(pre—miRNA)經(jīng)Dicer酶加工產(chǎn)生。通常，其在細(xì)胞質(zhì)中與Argonaute等蛋白分子形成miRISC(miRNA induced silencing complex)。在nuRNA的指引下，miRISC可以特異性地識(shí)別mRNA分子的3’端長(zhǎng)約30個(gè)堿基的非編碼區(qū)，并以完全或不完全匹配的方式與其結(jié)合，降解靶基

3、因mRNA或抑制其翻譯。由于存在這樣不同類型的匹配方式，使得一種miRNA可以與多種mRNA分子結(jié)合。生物信息學(xué)等研究結(jié)果表明，人類有1/3以上的蛋白編碼基因受miRNA調(diào)節(jié)。miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)目的基因的蛋白表達(dá)，發(fā)揮著類似癌基因或腫瘤抑制基因的功能，如在生物體發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、細(xì)胞增殖等過(guò)程中起重要作用。另外，蛋白質(zhì)相互作用在生命活動(dòng)中扮演著關(guān)鍵角色，參與了生物學(xué)中的許多生理病理活動(dòng)的調(diào)控，如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪切、分泌、細(xì)胞周期

4、調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞代謝等，也是尋找下游靶基因的重要手段之一。我們前期通過(guò)RNA干擾實(shí)驗(yàn)等發(fā)現(xiàn)S100A8通過(guò)NF—Kappa B信號(hào)通路參與喉癌的發(fā)生和發(fā)展，且可能位于P65下游、BCL—2上游，但S100A8在該通路中的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。迄今為止，有關(guān)S100A8基因上游microRNA調(diào)控及參與NF—Kappa B信號(hào)通路的具體機(jī)制研究均未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，我們通過(guò)生物信息學(xué)資源結(jié)合熒光素酶活性分析探尋S100A8基因上游

5、具有調(diào)控作用的microRNA分子；同時(shí)，通過(guò)喉癌中S100A8相互作用蛋白的研究，深入探討S100A8基因在喉癌中的上下游調(diào)控機(jī)制，一方面可為闡明S100A8基因在喉癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制創(chuàng)造條件并提供新的線索，另一方面為開(kāi)展以microRNA為靶點(diǎn)或通過(guò)蛋白相互作用設(shè)計(jì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的喉癌診斷和治療奠定基礎(chǔ)。 材料與方法： 利用生物信息學(xué)軟件對(duì)S100A8基因3’非翻譯區(qū)進(jìn)行microRNA靶向預(yù)測(cè)，采用終點(diǎn)PC

6、R和熒光定量PCR分別檢測(cè)S100A8靶向microRNA在不同細(xì)胞系和喉癌組織中的表達(dá)情況。構(gòu)建野生型及突變型S100A8基因熒光報(bào)告素酶表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞，通過(guò)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)分析靶向microRNA對(duì)S100A8基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，通過(guò)倒置顯微鏡和Transwell小室法觀察并檢測(cè)共轉(zhuǎn)染靶向microRNA及熒光報(bào)告素酶質(zhì)粒前后喉癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞體外侵襲能力的變化，綜合分析靶向micr

7、oRNA對(duì)Hep2生物學(xué)行為的影響。以喉癌Hep2細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)篩查S100A8相互作用蛋白質(zhì)并通過(guò)免疫共沉淀及細(xì)胞免疫熒光化學(xué)對(duì)相互作用蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)RNA干擾技術(shù)進(jìn)一步揭示相互作用蛋白質(zhì)之間的調(diào)控關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、S100A8 mRNA靶microRNA預(yù)測(cè) 采用MiRanda和RNA22軟件，我們?cè)赟100A8 mRNA第341bp堿基位置(3’非翻譯區(qū))預(yù)測(cè)到一個(gè)m

8、iR—24結(jié)合位點(diǎn)，其與大鼠的同源性高達(dá)95％。 二、喉癌中miR—24表達(dá) 采用U6—snRNA作為內(nèi)對(duì)照，以GES—1細(xì)胞的表達(dá)水平作為基準(zhǔn)，終點(diǎn)PCR及熒光定量PCR結(jié)果表明Hep2、HeLa、Bel、SGC7901、BGC823和HEK293細(xì)胞系中miR—24表達(dá)均明顯下調(diào)，ANOVA分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同樣，以癌旁正常組織為對(duì)照，10例喉癌組織中有7例樣本(7/10，70％)存在miR—24的

9、表達(dá)下調(diào)，雙側(cè)t檢驗(yàn)分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 三、miR—24對(duì)S100A8基因靶向調(diào)節(jié) 測(cè)序結(jié)果表明，我們成功地構(gòu)建了S100A83’UIR野生型和突變型熒光報(bào)告素酶表達(dá)載體。在Hep2和HEK293細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染野生型S100A8表達(dá)質(zhì)粒和miR—24前體組的報(bào)告基因活性相對(duì)于其它對(duì)照組明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而anti—miR—24能明顯逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)。熒光定量PCR和Western b

10、lot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比轉(zhuǎn)染了miR—24前體和野生型報(bào)告質(zhì)粒組的Hep2細(xì)胞中S100A8翻譯水平顯著降低(P<0.05)，而相應(yīng)mRNA的表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。 四、miR—24對(duì)喉癌Hep2細(xì)胞體外侵襲能力的影響 通過(guò)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染miR—24前體和野生型S100A83’UTR報(bào)告質(zhì)粒能明顯改變Hep2細(xì)胞的形態(tài)(變圓、減少)，并能顯著降低Hep2細(xì)胞的體外侵襲能力(P<0.05)。

11、 五、喉癌Hep2細(xì)胞系中S100A8相互作用蛋白質(zhì)篩查與鑒定 通過(guò)免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，篩查并鑒定了四種與S100A8相互作用的蛋白質(zhì)，分別為假想蛋白LOC80154、MHCⅠ類分子HLA—B、T—box1異構(gòu)體C類似物和SLAP1。免疫共沉淀和細(xì)胞免疫熒光化學(xué)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)HLA—B與S100A8蛋白存在相互作用。 六、HLA—B基因干擾效應(yīng)的檢測(cè) 以β—actin作為內(nèi)對(duì)照，RT-PCR結(jié)果顯示在siR

12、NA轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞第7天，HLA—B基因表達(dá)下調(diào)最為明顯，與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05)，但后兩組的干擾結(jié)果之間無(wú)顯著性差異。 七、HLA—B基因?qū)戆〩ep2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 經(jīng)流式細(xì)胞儀和Transwell小室法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HLA—B RNA干擾組較對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，且Hep2細(xì)胞發(fā)生了明顯的S期細(xì)胞周期阻滯。同時(shí)，干擾組細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組增強(qiáng)，跨膜細(xì)胞數(shù)也較對(duì)照

13、組明顯增多。ANOVA分析表明轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 八、HLA—B基因?qū)100A8基因表達(dá)的影響 以未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA組為對(duì)照，用管家基因β—actin校正S100A8基因的表達(dá)水平。RT-PCR及Western blot結(jié)果表明，S100A8基因在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中均有表達(dá)，但在轉(zhuǎn)染組表達(dá)明顯下調(diào)，ANOVA分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論： (1) m

14、iR—24通過(guò)與炎癥因子S100A83' UTR特定基序靶向結(jié)合負(fù)性調(diào)控該基因的表達(dá)。 (2) miR—24能影響Hep2細(xì)胞的表型，并抑制其侵襲能力，這些作用可能通過(guò)抑制S100A8的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。 (3)篩查并鑒定了喉癌中四種與S100A8相互作用的蛋白質(zhì)，分別為：假想蛋白LOC80154、MHCⅠ類分子HLA—B、T—box1異構(gòu)體C類似物和SLAP1； (4)首次證實(shí)HLA—B異常表達(dá)與喉癌的生物學(xué)行為相關(guān)