柑橘全基因組DNA甲基化分析及調(diào)控作用研究.pdf

1、表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變。真核生物中，表觀遺傳通過調(diào)控染色質(zhì)構(gòu)象進(jìn)而影響基因表達(dá)來(lái)控制植物的發(fā)育，其調(diào)控機(jī)制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和小干擾RNA。近年來(lái)，表觀遺傳在植物發(fā)育和環(huán)境互作中的調(diào)控作用被廣泛研究，但在柑橘上的研究尚少。為了揭示表觀遺傳在柑橘生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控作用，本課題研究了DNA甲基化在柑橘果實(shí)發(fā)育過程和愈傷類胡蘿卜素代謝的調(diào)控作用，并對(duì)柑橘基因組中組蛋白修飾酶基因進(jìn)行了鑒定和

2、分析。另外，本研究還以柑橘胚珠為材料，利用表觀組的研究方法解析了柑橘多胚發(fā)育過程中的表觀變化。主要研究結(jié)果如下:
　　1.果實(shí)發(fā)育過程中DNA甲基化的變化
　　通過毛細(xì)管電泳測(cè)定6個(gè)果實(shí)發(fā)育時(shí)期的DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化修飾隨著果實(shí)發(fā)育和成熟是動(dòng)態(tài)變化的。進(jìn)一步克隆了DNA甲基化控制基因，包括3類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因（CsMET1，CsCMTs and CsDRM1），一個(gè)染色質(zhì)重塑基因（CsDDM1）和去甲基化基

3、因（CsDMEs）。對(duì)上述基因在不同組織以及不同果實(shí)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，CsDRM1在幼苗、葉片和花中呈現(xiàn)高表達(dá);在果實(shí)發(fā)育過程中，CsMET1、CsCMT1、CsCMT2、CsDRM1、CsDMEs在果皮中偏好表達(dá)。通過對(duì)全基因組甲基化水平的測(cè)定和DNA甲基化相關(guān)基因的表達(dá)分析，說(shuō)明全基因組甲基化圖譜的建立是由甲基化和去甲基化共同作用形成的，且隨著生長(zhǎng)發(fā)育過程而變化。
　　2.5-氮胞苷處理誘導(dǎo)愈傷中類胡蘿卜素的降解

4、　　為了探究DNA甲基化在類胡蘿卜素中的調(diào)控作用，本研究利用去甲基化試劑5-氮胞苷(5azaC)對(duì)高積累類胡蘿卜素的愈傷系進(jìn)行了梯度處理。隨著處理濃度的升高，愈傷中類胡蘿卜素的含量逐漸降低。上游類胡蘿卜素的降解也造成了下游ABA含量的下降。對(duì)類胡蘿卜素代謝途徑中的基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，CpCCD1被大量誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。原核表達(dá)CpCCD1蛋白到類胡蘿卜素工程菌中的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CpCCD1對(duì)玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、番茄紅素有較強(qiáng)的降解作用。此外，

5、本研究發(fā)現(xiàn)5azaC處理雖然造成了全基因組范圍內(nèi)的去甲基化作用，但仍然有一些位點(diǎn)的甲基化水平升高。進(jìn)一步對(duì)控制DNA甲基化的基因進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，5azaC處理可以誘導(dǎo)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)，推測(cè)這些基因的上調(diào)表達(dá)造成了處理后某些位點(diǎn)甲基化水平的升高。對(duì)處理前后愈傷的表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，3380個(gè)基因在處理后差異表達(dá)，其中2047個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，1333個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)MYBs、WRKYs、NACs等大量的轉(zhuǎn)錄因子在處理后被激活

6、。進(jìn)一步的甲基化組分析發(fā)現(xiàn)5azaC的去甲基化作用主要發(fā)生在基因間區(qū)和基因的上游2kb和下游2kb區(qū)域。通過篩選，共鑒定出3082個(gè)甲基化差異基因（包括基因的啟動(dòng)子區(qū)和基因區(qū)），其中包含682個(gè)上調(diào)基因和2400個(gè)下調(diào)基因，說(shuō)明5azaC處理造成了廣泛的全基因組范圍內(nèi)的去甲基化作用。對(duì)甲基化差異基因的功能分類進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要分布在蛋白質(zhì)水解、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境響應(yīng)、激素代謝等途徑。
　　3.柑橘胚珠發(fā)育過程中發(fā)生了

7、全基因組范圍內(nèi)的甲基化修飾
　　本研究利用甲基化免疫共沉淀結(jié)合高通量測(cè)序(MeDIP-seq)的方法首次對(duì)柑橘胚珠發(fā)育過程中的甲基化組進(jìn)行了解析。以紅夏橙開花前10天（多胚起始前）和開花后15天不授粉（多胚起始后）的胚珠為材料進(jìn)行甲基化組分析，共鑒定了2349個(gè)甲基化差異基因，其中2245個(gè)基因上調(diào)，104個(gè)基因下調(diào)，大部分基因的甲基化水平上調(diào)說(shuō)明在這兩個(gè)時(shí)期發(fā)生了全基因組范圍內(nèi)的加甲基化修飾?？死锫。▎闻撸┦芫昂螅ㄩ_花前～1

8、天;開花后15天）的胚珠中也發(fā)現(xiàn)了全基因組范圍內(nèi)的加甲基化現(xiàn)象。推測(cè)在配子形成過程中發(fā)生去甲基化重排后，本研究選取的胚珠組織正處于重新恢復(fù)甲基化的階段。對(duì)紅夏橙多胚起始細(xì)胞發(fā)育前后兩個(gè)時(shí)期胚珠的轉(zhuǎn)錄組分析共得到1361個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和1126個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。功能分類顯示差異表達(dá)基因主要參與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)水解以及微管等生物學(xué)過程。進(jìn)一步基于前人通過遺傳學(xué)定位的多胚控制區(qū)域，分析了該區(qū)域內(nèi)甲基化變化的基因，并在該區(qū)域篩選出了可能與胚發(fā)

9、育相關(guān)的候選基因。
　　4.全基因組范圍內(nèi)鑒定和分析組蛋白修飾基因
　　基于已測(cè)序的甜橙基因組序列，共鑒定了136個(gè)組蛋白修飾基因，其中包括四類修飾基因:組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因（47個(gè)）、組蛋白去甲基化基因（23個(gè)）、組蛋白乙酰化基因（50個(gè)）以及組蛋白去乙?；颍?6個(gè)）。根據(jù)序列特點(diǎn)，將上述基因分為11個(gè)基因家族，并對(duì)這些基因的染色體分布、基因聚類、基因結(jié)構(gòu)以及保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析。為了研究這些基因在柑橘果實(shí)發(fā)育過程中的