LncRNA介導(dǎo)人基因組DNA甲基化研究.pdf

1、DNA甲基化作為一種在表觀遺傳學(xué)上非常關(guān)鍵的標記，在生物體中很多過程中發(fā)揮重要的功能。比如基因表達調(diào)控，細胞分化，疾病產(chǎn)生，胚胎發(fā)育等過程中DNA甲基化都發(fā)揮著舉足輕重的作用。目前，已經(jīng)報道的參與DNA甲基化過程的酶有：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（Dnmt1），DNA甲基轉(zhuǎn)移酶ⅢA（Dnmt3a），DNA甲基轉(zhuǎn)移酶ⅢB（Dnmt3b）。過去幾年，在研究植物中的DNA甲基化機制時發(fā)現(xiàn)，從頭合成甲基化中有siRNA和lncRNA的參與[1]。去年，

2、中國學(xué)者在小鼠的骨骼肌成肌細胞中發(fā)現(xiàn)有LncRNA Dum調(diào)控其靶基因Dppa2的DNA甲基化從而抑制該基因的表達，達到基因沉默的效果[2]。這證明在小鼠中l(wèi)ncRNA能夠通過介導(dǎo)Dnmts定位到基因的特定位點，導(dǎo)致該位點的DNA甲基化，從而調(diào)控基因表達，進而影響細胞功能。因此，探討在人細胞中l(wèi)ncRNA與Dnmts結(jié)合并且在基因甲基化過程的作用是否存在普遍現(xiàn)象具有重要意義，為解釋基因組DNA甲基化機制提供支持。
　　本文利用經(jīng)典

3、的RNA免疫共沉淀(RNA immunecoprecipitation)技術(shù)來捕獲由ES向NPC分化過程中能夠和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用的RNA[3]。并且通過特定的方法去除基因組DNA的干擾之后，鑒別所捕獲的RNA中是否有l(wèi)ncRNA，以此來證明在人細胞分化過程中l(wèi)ncRNA能夠參與DNA甲基化過程。用RIP捕獲能夠和Dnmt3b結(jié)合的RNA，通過生物信息學(xué)方法分析RNA的類型，用RIPSeeker分析Dnmt3b在基因組上可能的結(jié)合

4、位點。并且利用RIP測序數(shù)據(jù)，采用tophat及cufflink軟件聯(lián)合使用的方法對RIP數(shù)據(jù)進行組裝，并結(jié)合預(yù)測軟件（CPC、CPAT）評價這些得到的轉(zhuǎn)錄物是否存在開放閱讀框和開放閱讀框的長度及保守性，相鄰核苷酸三聚體在編碼與非編碼區(qū)分布的差異程度等一系列指標預(yù)測其編碼能力強弱，從而判斷一個轉(zhuǎn)錄物是不是屬于非編碼基因。結(jié)果小結(jié)如下：
　　1、在H9-ES細胞系，ES向NPC分化第二天的細胞和來自于ES的成熟NPC細胞中，我們共獲

5、得了14957個新的lncRNA分子，其中有44個lncRNA分子與mRNA反向配對；
　　2、在H9-ES細胞向NPC細胞分化過程中Dnmt3b和Dnmt3a的表達量處于動態(tài)變化過程中，兩者同時在分化第二天的時候表達量達到最高，并且Dnmt3b的表達量比Dnmt3a的表達量更高；
　　3、通過利用Dnmt3b和IgG抗體的RIP技術(shù)和RIPseeker分析軟件，我們發(fā)現(xiàn)在在ES細胞中l(wèi)ncRNA能夠和Dnmt3b結(jié)合，在l

6、ncRNA和基因組結(jié)合位點附近的基因有13個mRNA，lncRNA和microRNA及Y RNA各1個。這些RNA結(jié)合位點臨近基因的甲基化水平都是比較低的，這些基因的主要功能是和細胞跨膜運輸和增殖相關(guān)；
　　4、在H9-ES細胞向NPC細胞分化過程中l(wèi)ncRNA能夠和Dnmt3b結(jié)合，其結(jié)合位點臨近基因有25個mRNA，7個snoRNA，2個microRNA，lncRNA1個。并且發(fā)現(xiàn)這些RNA結(jié)合位點臨近基因的甲基化情況都比較高

7、，在這些結(jié)合位點呈現(xiàn)出很高的CpG甲基化現(xiàn)象，并且這些基因的主要功能都是和細胞分化及神經(jīng)分化相關(guān)；
　　5、NPC細胞中也發(fā)現(xiàn)有和Dnmt3b結(jié)合的RNA，其結(jié)合位點臨近基因有132個mRNA，16個snoRNA，5個microRNA和2個lncRNA。通過UCSC，我們發(fā)現(xiàn)這些能夠和Dnmt3b結(jié)合的RNA臨近基因的DNA甲基化水平都比未分化的ES細胞中高，并且在這些結(jié)合位點的CpG甲基化也很高。并且其結(jié)合位點附近基因的功能都是