中國對蝦基因組DNA甲基化MSAP技術(shù)的建立與應(yīng)用.pdf

1、本文建立并優(yōu)化了中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)基因組 DNA甲基化敏感擴增多態(tài)性(Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)技術(shù)，從表觀遺傳學角度分析討論了中國對蝦野生群體和人工選育種黃海1號不同組織間的甲基化水平和多態(tài)性差異，分析了在氨氮和 pH脅迫條件下中國對蝦基因組DNA的甲基化模式，探討了甲基化修飾是否參與中國對蝦抗逆性狀的分子機制，以期為

2、中國對蝦抗氨氮和pH新品種培育提供理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容分為以下三個部分：
　　第一部分建立并優(yōu)化了中國對蝦DNA甲基化分析的MSAP程序和體系。主要從酶切體系、預(yù)擴增 PCR體系和選擇性擴增體系三個方面進行。包括內(nèi)切酶量、酶切時間、模板濃度、預(yù)擴增緩沖液量以及聚丙烯酰胺凝膠濃度等條件的優(yōu)化，獲得最佳反應(yīng)程序和體系。酶切反應(yīng)：7.5U同裂酶HpaII或MspI，EcoRI對1uL DNA模板37℃酶切8h；預(yù)擴增反應(yīng)：10倍稀釋連

3、接產(chǎn)物為模板，1U Taq DNA Polymerse，2.2 uL10×Taq buffer(Mg2+=33pmol)共20體系；選擇性擴增反應(yīng)：10倍稀釋預(yù)擴增產(chǎn)物為模板，30pmol引物，1U Taq DNA Polymerse，2.0 uL10×Polymerse buffer。選擴增產(chǎn)物經(jīng)變性在6％聚丙烯酰胺凝膠電泳下進行MSAP分析。
　　第二部分應(yīng)用建立的MSAP技術(shù)分別對中國對蝦野生群體和選育品種―黃海1號‖的肌肉

4、、鰓、血液三種組織基因組DNA的CCGG甲基化水平進行對比分析，試圖從表觀遺傳學角度探討影響中國對蝦生長性狀的分子機制。采用30對引物進行選擇性擴增，結(jié)果顯示：中國對蝦野生群體肌肉、鰓和血液的甲基化比例分別為23.1%、22.3%和19.7%；黃海1號肌肉、鰓和血液的甲基化比例分別為21.4%、19.6%和18.9%。中國對蝦野生群體和―黃海1號‖同一組織間的甲基化水平不同（P≤0.05），而肌肉、鰓和血液不同組織間的甲基化水平也各不相

5、同（P≤0.05）。DNA甲基化多態(tài)性分析結(jié)果表明：中國對蝦野生群體和―黃海1號‖各組織的多態(tài)性條帶轉(zhuǎn)變中，鰓組織的多態(tài)性變化幅度最大，Class d、Class c、Class b中 typeⅠ均發(fā)生增高或降低；肌肉其次，只在Class b中typeⅠ升高54.2%；而血液最為穩(wěn)定，無明顯變化。
　　第三部分應(yīng)用MSAP技術(shù)對不同濃度氨氮和不同pH梯度急性脅迫處理的中國對蝦肌肉組織進行基因組DNA甲基化模式分析，以期為中國對蝦抗

6、氨氮和抗pH品系的選育提供理論依據(jù)。氨氮脅迫試驗結(jié)果表明：中國對蝦DNA甲基化水平變化在23.66%-24.17%，當NH4Cl≤8mg/L時，中國對蝦DNA總甲基化水平下降，但與對照組相比，差異不顯著（P≧0.05），而半甲基化水平則發(fā)生明顯上升（P≤0.05）。當NH4Cl≥8mg/L，DNA總甲基化水平上升，其上升趨勢與氨氮濃度呈一定的正相關(guān)性。pH脅迫試驗結(jié)果表明：中國對蝦 DNA甲基化水平變化的幅度為21.73%-22.11%