IVF出生小鼠及其后代基因組DNA甲基化修飾變化研究.pdf

1、本文對(duì)IVF出生小鼠及其后代基因組DNA甲基化修飾變化進(jìn)行了研究。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：IVF出生小鼠及其之間交配出生后代行為學(xué)、形態(tài)學(xué)及全基因組甲基化模式的研究。
　　 目的：通過(guò)IVF小鼠模型的建立，完成以IVF為代表的ART出生群體之間婚育安全性動(dòng)物模型方面的評(píng)估，揭示ART的對(duì)人類未來(lái)可能的表觀遺傳學(xué)效應(yīng)。
　　 方法：①建立IVF小鼠模型，獲得IVF出生F1代小鼠；6-7周齡時(shí)，IVF

2、F1代小鼠雌雄性合籠，自然交配受孕，獲其F2子代；②以自然出生小鼠為對(duì)照，分別于6-7周齡時(shí)，進(jìn)行F1代，F(xiàn)2代小鼠的水迷宮實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)其學(xué)習(xí)及記憶能力；③以自然出生小鼠為對(duì)照，開(kāi)展F1代，F(xiàn)2代小鼠的體重、器官測(cè)量，外表結(jié)構(gòu)畸形觀察、組織器官的大體和組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)和分析；④應(yīng)用小鼠全基因組甲基化芯片，對(duì)F1代及F2代小鼠及自然妊娠出生小鼠各四只進(jìn)行全基因組水平的甲基化的檢測(cè)，比較三組全基因組水平的甲基化的模式；⑤選取8個(gè)在F1、F2代同

3、時(shí)發(fā)生高甲基化的啟動(dòng)子位點(diǎn)：Crygα、Fgf1、Nos3、Mb、Myog、Notch3、Th和Vαv1以及4個(gè)只有在F2代發(fā)生高甲基化的啟動(dòng)子位點(diǎn)：Col9α2、Fgf6、Lck和Slc5α1進(jìn)行亞硫酸氫鹽測(cè)序，對(duì)芯片的部分結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；⑥采用熒光定量PCR方法檢測(cè)經(jīng)亞硫酸氫鹽測(cè)序證實(shí)在F1代陽(yáng)性的位點(diǎn)：Fgf1、Nos3、Notch3、Th和Vαv1以及在F2代的陽(yáng)性位點(diǎn)：Col9α2、Fgf1、Fgf6、Nos3、Notch3、S

4、lc5α1、Th及Vαv1的表達(dá)，明確甲基化狀態(tài)其對(duì)其mRNA表達(dá)情況的影響。
　　 結(jié)果：⑴成功建立IVF F1代小鼠模型及F2代模型；⑵水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示IVF F1、F2代組與自然妊娠出生小鼠相比在潛伏期、游泳距離等方面無(wú)顯著性差異；⑶IVF F1、F2代的體重、器官比重及組織形態(tài)學(xué)與自然妊娠出生小鼠相比無(wú)顯著性差異；⑷小鼠腦組織全基因組甲基化芯片結(jié)果顯示，在F1代中共有225個(gè)CpG島及191啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了高甲基化；22個(gè)

5、CpG島和28啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了低甲基化。F2代有196個(gè)CpG島和213個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化；69個(gè)CpG島，56個(gè)啟動(dòng)子發(fā)生了低甲基化。F1代與F2代相比，共有113個(gè)啟動(dòng)子和143個(gè)CpG島發(fā)生了共同的高甲基化；⑸在經(jīng)亞硫酸氫鹽測(cè)序驗(yàn)證的8個(gè)啟動(dòng)子中，F(xiàn)gf1、Nos3、Notch3、Th及Vαv1在F1、F2代甲基化的程度較自然妊娠組高，差異有顯著性，符合芯片發(fā)現(xiàn)的結(jié)果。4個(gè)只在F2代發(fā)生高甲基化的位點(diǎn)中，有3個(gè)發(fā)生了高甲基化，符

6、合芯片的發(fā)現(xiàn)；⑹熒光定量PCR方法顯示Fgf1、Nos3、Notch3、Lck、Co19a2、Fgf6及Slc5α1的表達(dá)受到其甲基化狀態(tài)得影響，其mRNA的表達(dá)有不同程度的降低，但Th、Vαv1沒(méi)有顯示這種趨勢(shì)。
　　 結(jié)論：①I(mǎi)VF對(duì)F1、F2代小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力、生長(zhǎng)發(fā)育及器官形態(tài)等沒(méi)有明顯的影響；②IVF出生小鼠腦組織基因組DNA甲基化修飾存在改變，尤以高甲基化異常明顯，并可影響到基因的表達(dá)；③IVF出生小鼠的部分基因

7、組DNA甲基化修飾異?？梢詡鬟f給其相互交配出生的后代，同時(shí)這些后代也有新的DNA甲基化修飾異常發(fā)生，此類異常甲基化同樣可影響基因的表達(dá)。
　　 第二部分：IVF所致異常甲基化向后代傳遞的遺傳方式研究。
　　 目的：分析IVF出生小鼠基因組DNA異常甲基化的子代傳遞方式，為探索異常甲基化發(fā)生機(jī)制和可能阻斷途徑提供研究基礎(chǔ)。
　　 方法：①將IVF出生的雌性及雄性F1代小鼠分別與野生型雄性及雌性小鼠交配獲得母源和父源

8、IVF F2代小鼠；②選取3個(gè)前期研究中發(fā)現(xiàn)在F1、F2代同時(shí)發(fā)生高甲基化位點(diǎn)：Fgf1、Nos3、Notch3以及3個(gè)只有在F2代發(fā)生高甲基化位點(diǎn)：Col9α2、Fgf6、Slc5α1，分別在母源和父源IVF F2代小鼠考察上述啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化模式；③熒光定量PCR方法檢測(cè)Fgf1、Nos3、Notch3、Col9α2、Fgf6及Slc5α1在母源和父源IVF F2代小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)，明確甲基化狀態(tài)其對(duì)其mRNA表達(dá)的影響。

9、
　　 結(jié)果：⑴2個(gè)在IVF F1和F2代同時(shí)發(fā)生高甲基化的位點(diǎn)：Fgf1、Notch3以及3個(gè)只有在IVF F2代發(fā)生高甲基化位點(diǎn)：Col9α2、Fgf6和Slc5α1，在母源IVF F2代小鼠腦組織中，其甲基化程度與自然妊娠出生小鼠無(wú)顯著差異。但Nos3仍表現(xiàn)出高甲基化，且熒光定量PCR結(jié)果顯示Nos3基因的表達(dá)也存在不同程度的降低；⑵3個(gè)在IVF F1和F2代同時(shí)發(fā)生高甲基化的位點(diǎn)：Fgf1、Nos3、Notch3以及3個(gè)

10、只有在F2代發(fā)生高甲基化位點(diǎn)：Col9α2、Fgf6及Slc5α1，在父源IVF F2代小鼠的腦組織中，其甲基化程度與自然妊娠出生小鼠均無(wú)顯著差異。
　　 結(jié)論：①I(mǎi)VF F1代雄性小鼠發(fā)生的基因組DNA甲基化修飾異常，在其后代可得以糾正；②IVF F1代雌性小鼠發(fā)生的甲基化修飾異常，存在傳遞給其后代的風(fēng)險(xiǎn)；③IVF出生小鼠相互交配出生的F2代小鼠的異常甲基化可能主要是通過(guò)母源傳遞。
　　 第三部分：Nos3啟動(dòng)子在母源

11、F3代的甲基化狀態(tài)及IVF出生雙胎子代臍血印跡基因調(diào)控區(qū)KvDMR1、H19/IGF2 DMR及PEG1甲基化狀況。
　　 目的：進(jìn)一步考察在母源IVF F2代小鼠中發(fā)生異常的Nos3位點(diǎn)是否可以進(jìn)一步傳遞；研究IVF雙胎子代臍血中幾個(gè)重要印記基因調(diào)控區(qū)的甲基化狀況，分析IVF雙胎子代中印跡狀態(tài)異常風(fēng)險(xiǎn)。
　　 方法：①將論文第二部分的母源IVF F2代進(jìn)一步與野生型的C57/BL6J雄性小鼠之間交配，獲的母源IVF F

12、3代，以自然妊娠子代為對(duì)照；同時(shí)熒光定量RT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)Nos3所調(diào)控基因的mRNA表達(dá)水平；②共收集59對(duì)雙胎臍血標(biāo)本，其中29對(duì)IVF雙胎組成研究組，30對(duì)自然妊娠雙胎組成對(duì)照組，采用亞硫酸氫鹽測(cè)序?qū)蓚€(gè)母源性甲基化印記區(qū)域(KVDMR1、PEG1)及一個(gè)父源性甲基化印記區(qū)域(H19/IGF2 DMR)進(jìn)行甲基化模式檢測(cè)和比較。
　　 結(jié)果：⑴在母源IVF F2代小鼠中異常甲基化的Nos3位點(diǎn)在母源IVF F3代與自然

13、妊娠出生的小鼠相比已無(wú)差別，Nos3基因表達(dá)水平到母源F3代已經(jīng)無(wú)顯著性變化；⑵IVF和自然妊娠雙胎子代均未發(fā)現(xiàn)有PEG1基因的印記缺失，二組甲基化程度無(wú)顯著性差異(P=0.103)。3例IVF雙胎子代中存在KvDMR1低甲基化，甲基化程度在21％左右，發(fā)生率為5.08％(3/58)，1例自然妊娠雙胎子代存在低甲基化，發(fā)生率為1.67％(1/60)，二者相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.611)。IVF和自然妊娠雙胎子代各有1例存在H19/I