山羊DIO3基因組織特異性表達及DNA甲基化分析.pdf

1、DIO3基因在甲狀腺激素代謝過程中發(fā)揮著重要的作用，它對胎兒發(fā)育、新生兒生長有著非常重要的作用，尤其對哺乳動物大腦的發(fā)育起著至關重要的作用。為了進一步理解DIO3基因的結構和功能，我們從南江黃羊的心肌中分離鑒定出DIO3基因，采用實時熒光定量PCR技術研究南江黃羊在出生后3d、30 d、60 d、90 d和120 d這5個生長階段DIO3在不同組織中mRNA水平的表達差異。同時應用原位雜交技術對大腦不同區(qū)域的DIO3 mRNA進行了定位

2、分析;此外，采用MassArray甲基化定量檢測方法對出生后3d的南江黃羊不同組織DIO3基因內部的CpG島的甲基化狀態(tài)進行了檢測。主要結果如下:
　　(1)克隆得到南江黃羊DIO3基因的編碼區(qū)全序列，長度為906 bp，編碼的氨基酸數目為301個;山羊DIO3的編碼序列與小鼠、大鼠、人、豬、綿羊和牛的序列相似度分別為83.61％、84.37％、88.52％、90.20％、90.95％和97.46％;而DIO3的編碼氨基酸序列與牛

3、的同源性為98.67％，與小鼠、大鼠、綿羊、人和豬的相似度分別為89.47％、89.80％、92.36％、92.76％和93.11％。保守的TGA密碼（編碼硒代半胱氨酸）對催化活性是至關重要的。
　　(2)對DIO3基因的生物信息學分析結果表明，DIO3蛋白的分子重為33.9 kDa，且理論等電點為6.45。DIO3氨基酸包含11個磷酸化位點;二級結構預測發(fā)現山羊DIO3蛋白主要由α-螺旋(41.20％)、無規(guī)卷曲(44.52％)

4、和延伸片段(14.29％)組成。進化關系分析結果表明山羊DIO3的核苷酸序列同綿羊和牛的親緣關系最近，山羊DIO3首先與綿羊形成一支，然后再和牛、豬和犬類形成一個分支;且山羊DIO3與哺乳動物的親緣關系更近，而與三斑海豬魚和藍刻齒雀鯛的親緣關系要遠。
　　(3)在南江黃羊出生后的五個時期均檢測到了DIO3 mRNA的表達，但在肝、腎和背最長肌中的表達水平較高;其次為心和腦;在肺中的表達水平較低。
　　(4)原位雜交探針成功揭

5、示了DIO3 mRNA在大腦不同區(qū)域的空間表達模式。在大腦皮質中，DIO3 mRNA在腦膜和分子層的表達十分微弱，但其中的神經纖維表達卻十分明顯。DIO3轉錄物在腦干中的神經元和神經纖維網中廣泛分布。在小腦的分子層、浦肯野細胞層和顆粒細胞層中，DIO3 mRNA普遍呈現出中等程度的表達，但在小腦白質中呈現出極高濃度的表達。此外，在延髓中，DIO3 mRNA的表達信號主要集中于神經纖維網。相似的，DIO3 mRNA在下丘腦和白髓中的表達也

6、主要分布于神經纖維網中。
　　(5)山羊DIO3基因包含一個保守的CpG島，幾乎覆蓋整個編碼區(qū)(g.71-851)，共包括51個CpG位點，且它們的平均甲基化水平位于0.03-0.79之間。在不同的組織中甲基化模式具有保守性。甲基化分析結果顯示DIO3基因內部的CpG島的甲基化程度在5'區(qū)域和3'區(qū)域存在差異，編碼區(qū)內的5'區(qū)域(CpGs_1～24)的甲基化程度顯著低于(P＜0.01)3'區(qū)域(CpGs_25～51);六個測試組織