大足黑山羊PHLDA2基因克隆、定位、組織表達(dá)、印記狀況和甲基化分析.pdf

1、山羊的養(yǎng)殖是動(dòng)物農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一。近年來，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，營養(yǎng)價(jià)值高、有益于身體健康的食品越來越受到歡迎。羊肉營養(yǎng)價(jià)值高使羊肉市場需求量的增加，因此提高山羊繁殖率成為滿足山羊需求市場的關(guān)鍵。綿羊、山羊的繁殖率普遍較低限制了山羊大規(guī)模的養(yǎng)殖。成活羔羊數(shù)是影響繁殖性能因素之一。有關(guān)研究報(bào)道，胎盤的正常生長和發(fā)育起到關(guān)鍵的作用，胎盤是胎體營養(yǎng)供應(yīng)的源泉，對(duì)胎體的正常生長發(fā)育至關(guān)重要。
　　PHLDA2(pleckstrin ho

2、mology-like domain，family A，member2，又稱為IPL或TSSC3)，編碼含有PH(pleckstrin homology)同源域的小型細(xì)胞質(zhì)蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)、包內(nèi)運(yùn)輸?shù)裙δ?。研究表明，在人和鼠中，PHLDA2基因?yàn)槟冈幢磉_(dá)的印記基因，調(diào)控胎盤的生長發(fā)育和糖原儲(chǔ)存。因此，對(duì)山羊PHLDA2基因相關(guān)研究具有重要意義。本研究采用RACE方法克隆了山羊PHLDA2基因cDNA全長并進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析

3、，同時(shí)構(gòu)建了該基因在不同組織中表達(dá)譜;通過RT-PCR產(chǎn)物直接測序法分析了該基因在F1代胎盤組織的印記狀況;采用巢式PCR法克隆了山羊PHLDA2基因啟動(dòng)子序列并利用亞硫酸鹽修飾測序法(BSP)和甲基化特異性PCR(MSP)法繪制了該基因啟動(dòng)子區(qū)域和第一外顯子區(qū)域在胎盤和脾臟組織甲基化圖譜。通過實(shí)驗(yàn)得到如下結(jié)果:
　　利用PCR和RACE方法獲得了山羊PHLDA2基因全長cDNA序列，為935bp，包含420bp的開放閱讀框、62

4、bp的5'端UTR序列和450bp的3'UTR; polyA長度為32bp，終止密碼子為TAA;其編碼區(qū)編碼一段140個(gè)氨基酸殘基的蛋白序列，預(yù)測其分子量大小為15638.7Da，等電點(diǎn)為9.18。
　　對(duì)推斷的PHLDA2基因核苷酸序列和編碼氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明:PHLDA2與已報(bào)道的牛、豬、人、獼猴、馬PHLDA2基因核苷酸相似性分別為91％、90％、89％、90％，、90％;與來源于牛（Bos taurus

5、，NP_001069989）、豬（Sus scrofa，NP_001167528）、人(Homo sapiens，NP_003302)的PHLDA2蛋白同源性分別達(dá)到99％、93％、83％，而且整體上都很保守，說明它們的PHLDA2從共同的祖先蛋白開始分化發(fā)生在相對(duì)較近的時(shí)間里。
　　采用Real-time PCR方法對(duì)山羊PHLDA2基因在不同組織間的表達(dá)譜構(gòu)建。熒光定量結(jié)果表明PHLDA2基因在心臟、肝臟、胃、肺臟、腎臟、大腦

6、、舌、胎盤、肌肉組織中都能檢測到，但在脾臟中不表達(dá)。胎盤中mRNA含量(P＜0.01)顯著高于其它組織，在其它組織中，PHLDA2基因表達(dá)量極低較低且組織間差異均不顯著(P＞0.05)。PHLDA2基因表達(dá)方式和功能在物種間具有保守性，有理由認(rèn)為PHLDA2基因同樣具有負(fù)調(diào)控山羊胎盤的生長和功能的作用。
　　在牛的胎體和胎盤中，PHLDA2基因被證明為母源表達(dá)基因。印記分析結(jié)果表明山羊胎盤PHLDA2基因?yàn)槟冈幢磉_(dá)基因，進(jìn)一步證明

7、了PHLDA2基因印記在哺乳動(dòng)物存在保守性。通過將cDNA序列與NCBI中的山羊基因組序列進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)PHLDA2基因被定位于山羊29號(hào)染色體，也與NAP1L4和SLC22A18相鄰，這一結(jié)果為山羊該印記區(qū)域的分離與功能的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。
　　以大足黑山羊肌肉組織提取的基因組DNA為模板，采用巢式PCR擴(kuò)增，克隆片段長1842bp，包括20bp的5'UTR區(qū)域和1822bp啟動(dòng)子區(qū)域序列。發(fā)現(xiàn)得到3個(gè)核心啟動(dòng)子序

8、列，分別為:TAGGCTGTTTTGAAAGTGGGGGCCCTGGAGCAGGTGGGGCCCCACAGATC(起始:-990，結(jié)束:-836，得分:0.97)、 GCCCGGGGGCGTGCCCGGGGCGGGGGGGGCGGAGCGCGCCAGCGCGGCCA（起始:-82，結(jié)束:-42,得分:0.86）和GCGCGGCCACTATAAAGGCGGCTCCCACGCCGCCTGAGTGCATCCCTCAC(起始:-40，結(jié)束:9，

9、得分:1.0)。綜合三種預(yù)測結(jié)果，-40bp-9bp區(qū)域可能存在啟動(dòng)子活性中心。
　　采用甲基化特異性PCR(MSP)方法，對(duì)山羊胎盤組織和脾臟組織PHLDA2基因啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)域CpG島甲基化分析。甲基化圖譜繪制結(jié)果表明啟動(dòng)子區(qū)域胎盤組織和脾臟組織甲基化水平分別為22.6％和36％，第一外顯子區(qū)域甲基化水平胎盤組織和脾臟組織甲基化水平分別為1.28％和44.2％，綜上結(jié)果，山羊PHLDA2基因在胎盤組織和脾臟組織中CpG島