PHLDA2基因?qū)ψ甜B(yǎng)細(xì)胞增殖及凋亡能力的調(diào)控.pdf

1、目的：
　　滋養(yǎng)細(xì)胞向子宮的增殖、遷移和侵襲是人類胚胎植入和胎盤形成的重要環(huán)節(jié)。妊娠期滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮壁間質(zhì)、子宮肌層內(nèi)1/3和螺旋小動脈，將胎盤固在子宮壁上，并將螺旋小動脈轉(zhuǎn)化成低阻力、高容量的血管，完成血管重鑄。研究發(fā)現(xiàn)胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤不足而導(dǎo)致子宮螺旋動脈重構(gòu)障礙是子癇前期的起始性病理變化，因滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮壁過淺，從而螺旋動脈血管重構(gòu)深度不足，導(dǎo)致胎盤灌注不足，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，誘發(fā)子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲與腫瘤的侵襲有許

2、多相似之，但在許多內(nèi)分泌及旁分泌因子的調(diào)控下，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲呈現(xiàn)嚴(yán)格的時空限制，這些因素有些是促進滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的，有些是抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲的，任何一個因素的明顯失調(diào)都可能導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲異常而導(dǎo)致妊娠相關(guān)疾病。早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲不足是與包括子癇前期和胎兒生長受限在內(nèi)的妊娠病理相關(guān)的，而其過度侵襲則與葡萄胎及絨癌相關(guān)。
　　印跡基因是一種使父源或母源等位基因特異表達的表觀遺傳學(xué)修飾，僅表達親本一方遺傳信息的一類基因。印跡基因與早期

3、胚胎、胎盤及新生兒發(fā)育相關(guān)。印跡基因表達水平的改變會導(dǎo)致胚胎生長異常，甚至造成胚胎死亡。
　　PHLDA2(pleckstrin homology-like domain, family A, member2，又名IPL,TSSC3或BWR-1C)是一個母源表達父源印跡的印跡基因，主要表達于人胎盤絨毛的細(xì)胞滋養(yǎng)層及小鼠胎盤迷路滋養(yǎng)層[12]。該基因定位于人染色體11p15.5腫瘤抑制基因區(qū)，許多學(xué)者對其基因結(jié)構(gòu)和功能進行了一定的研

4、究，研究結(jié)果表明PHLDA2正常的表達水平對于胚胎發(fā)育是至關(guān)重要的，并且可以作為正常胚泡形成的分子標(biāo)志。PHLDA2編碼一包含血小板同源(pleckstrin-homology，PH)結(jié)構(gòu)域的胞漿蛋白，通過其PH結(jié)構(gòu)域與磷酸烯醇酯的結(jié)合參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)及胞內(nèi)囊泡運輸?shù)纫幌盗羞^程。
　　印跡基因已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的特點。由于在許多產(chǎn)科的疾病中，當(dāng)胎盤娩出后，患者的體征和臨床癥狀多緩解，因此其發(fā)病機制可歸因于胎盤組織滋

5、養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育不良，如本文提到的子癇、胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育受限等，印跡基因在其發(fā)病機制上可能具有一定的作用。目前的大量研究雖然已證實這些疾病與多種印跡基因的表達異常有關(guān)，但其具體機制尚未明了。若能進一步闡明產(chǎn)科疾病中印跡基因的調(diào)控機制及具體作用，將有利于我們深入了解疾病的病因，從而幫助臨床預(yù)防、診斷和治療。
　　本研究利用Real-time PCR、Western blot和免疫組化技術(shù)檢測并比較子癇患者和正常對照胎盤組織中PHLDA2的

6、表達情況，并分析其在子癇前期表達的臨床意義。通過構(gòu)建PHLDA2過表達載體，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)和病毒感染的方式在滋養(yǎng)細(xì)胞JEG3和原代分離培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞中過表達PHLDA2，通過檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達，及CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡等技術(shù)手段研究過表達和低表達PHLDA2基因及蛋白后對滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并初步探討PHLDA2對滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和凋亡的作用機制，以此說明PHLDA2在子癇發(fā)病過程中的作用及可能的生

7、物學(xué)機制。本研究將為子癇前期的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分 PHLDA2在子癇前期患者胎盤組織中的表達
　　收集15例晚期足月妊娠胎盤組織和15例重度子癇前期患者胎盤組織，實驗對象均符合以下標(biāo)準(zhǔn):既往月經(jīng)規(guī)則，本次妊娠經(jīng)過正常，無任何合并癥和并發(fā)癥，既往無不良妊娠史，無原發(fā)高血壓、糖尿病、腎病等病史。應(yīng)用熒光實時定量PCR法，western bolt檢測胎盤中PHLDA2的表達量是否有差

8、異。應(yīng)用免疫組化方法，檢測PHLDA2基因在胎盤組織中的表達部位。
　　第二部分 PHLDA2過表達對滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　體外培養(yǎng)HTR-8滋養(yǎng)細(xì)胞、JEG-3、Bewo、JAR細(xì)胞，應(yīng)用熒光實時定量PCR法，western bolt檢測四種細(xì)胞中PHLDA2的表達量。查找NCBI數(shù)據(jù)庫，設(shè)計引物擴增PHLDA2基因CDS區(qū)，構(gòu)建PHLDA2過表達載體pcDNA3.1-PHLDA2。根據(jù)前述實驗結(jié)果，選擇PHLDA

9、2表達量最低的JEG-3滋養(yǎng)細(xì)胞株進行轉(zhuǎn)染，實驗設(shè)置對照組(Control)、空載體轉(zhuǎn)染組(Vector)以及PHLDA2轉(zhuǎn)染組(PHLDA2)，于轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進行后續(xù)實驗。CCK-8檢測各組細(xì)胞的增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡比率。Western blot檢測各組細(xì)胞CDK1、CDK2、cyclinA、cyclinB1、p27以及cleaved-caspase-3的表達，試劑盒檢測各組細(xì)胞caspase-3的活性。<

10、br>　　第三部分 PHLDA2低表達對滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響
　　根據(jù)siRNA設(shè)計原則設(shè)計并合成3條siRNA干擾序列以及1條陰性對照序列，根據(jù)前述實驗結(jié)果，選擇PHLDA2表達量最高的Bewo細(xì)胞株進行轉(zhuǎn)染，48 h后Real-time PCR以及Western blot檢測各組細(xì)胞的PHLDA2的表達。選擇干擾效率最高的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實驗設(shè)置對照組(Control)、陰性對照組（siRNA-NC）、PHLDA2干擾組(s

11、iRNA-PHLDA)，48 h后收集細(xì)胞。Real-time PCR以及Westernblot檢測各組細(xì)胞PHLDA2的表達。CCK-8檢測各組細(xì)胞的增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的周期變化。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　我們利用熒光實時定量PCR和western blot方法檢測PHLDA2在正常晚孕期胎盤和重度子癇前期患者胎盤中的表達量。發(fā)現(xiàn)PHLDA2mRNA和PHLDA2蛋白在重度子癇前期患者胎盤組織中的

12、表達水平顯著高于正常晚孕組。進一步我們應(yīng)用免疫組化檢測PHLDA2在孕足月胎盤中的表達部位，發(fā)現(xiàn)PHLDA2在胎盤中主要表達在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞中。
　　第二部分
　　我們利用熒光實時定量PCR檢測HTR-8、JEG-3、Bewo、JAR四種滋養(yǎng)細(xì)胞系中PHLDA2mRNA的表達量，Western bolt檢測四種細(xì)胞中PHLDA2蛋白的表達量，發(fā)現(xiàn)Bewo細(xì)胞中PHLDA2mRNA極其蛋白的表達量最多，JEG-3細(xì)胞的表達量非常

13、少。CCK-8檢測各組細(xì)胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)JEG-3增殖能力最強，而Bewo細(xì)胞增殖能力最弱。
　　轉(zhuǎn)染入PHLDA2質(zhì)粒的JEG-3細(xì)胞中PHLDA2表達明顯上調(diào)(P＜0.05)，而空載體質(zhì)粒組與空白組沒有顯著差別。在轉(zhuǎn)染后48小時，通過CCK-8法檢測PHLDA2重組質(zhì)粒、空載體質(zhì)粒、和空白對照組的增殖能力，研究發(fā)現(xiàn)JEG-3細(xì)胞過表達PHLDA2后，細(xì)胞的增殖能力降低，Western blot檢測細(xì)胞周期蛋白cyclinA、

14、 cyclin B1及CDK1、CDK2表達減少，凋亡相關(guān)蛋白p27及cleaved-caspase3表達增多。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)JEG-3過表達PHLDA2基因后，細(xì)胞凋亡增加。
　　第三部分
　　轉(zhuǎn)染入siRNA-PHLDA2的Bewo細(xì)胞中PHLDA2mRNA和日PHLDA2蛋白表達水平明顯下調(diào)(P＜0.05)，而無序siRNA和空白組沒有顯著差別。在轉(zhuǎn)染后48小時，通過CCK-8法檢測siRNA-PHLDA2重組質(zhì)粒

15、、無序siRNA和空白對照組的增殖能力，研究發(fā)現(xiàn)Bewo細(xì)胞降表達PHLDA2后，細(xì)胞的增殖能力增強(P＜0.05)，而無序的siRNA組與空白組沒有顯著差別。westem blot檢測細(xì)胞周期蛋白cyclinA cyclin B1及CDK1、CDK2表達增多，p27及cleaved-caspase3表達減少。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)Bewo降表達PHLDA2基因后，細(xì)胞凋亡減少。
　　結(jié)論：
　　1、無論基因水平還是蛋白水平，P