VEGF-A,VEGF-C及MMP-2表達(dá)調(diào)控膽管癌增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力及細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:膽管癌(cholangiocarcinoma)是較為少見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，約占人類(lèi)全部消化道惡性腫瘤病例總數(shù)的2～3％左右。最早由Durand Fardel于1840年報(bào)道，其來(lái)源于膽管上皮細(xì)胞，在肝臟及膽道系統(tǒng)的惡性腫瘤中較為常見(jiàn)，約占肝膽系統(tǒng)腫瘤的10％～15％左右。在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率約為1.2/10萬(wàn)，但近十年來(lái)膽管癌的發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)，在我國(guó)其發(fā)病率以每年遞增5％的速度上升，是消化道腫瘤中上升速度最快的腫瘤。盡管近

2、年來(lái)外科手術(shù)、化療、放療、免疫治療等在膽管癌的治療上取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但由于膽管癌特殊的病理特征和病灶特殊的解剖位置等諸多原因，導(dǎo)致膽管癌患者缺乏早期特異性臨床表現(xiàn)及有效的早期診斷手段，當(dāng)患者出現(xiàn)癥狀就診時(shí)多數(shù)已處于中晚期，難以獲得根治性切除，這使得手術(shù)后患者3年生存率僅為35％至50％，而5年生存率僅有不到10％，在我國(guó)僅有5％左右。因其缺乏有效的綜合治療手段，故診治水平至今未取得突破性的進(jìn)展，嚴(yán)重危害了我國(guó)人民的健康。因此，研究膽管

3、癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制，了解膽管癌進(jìn)展過(guò)程中可能的分子步驟，尋求膽管癌惡性轉(zhuǎn)化的靶點(diǎn)及膽管癌的靶向治療已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。
　　血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）參與血管淋巴管生成的各個(gè)環(huán)節(jié)，是目前公認(rèn)最有效也是最重要的一種促血管生長(zhǎng)的特異性因子。在眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，VEGF都扮演極為重要的角色，而且是腫瘤血管形成最為成重要的始動(dòng)因子之一。
　　MMP-2基因是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族中最主要也是分布最

4、廣的成員，其主要作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲過(guò)程中的組織學(xué)屏障，進(jìn)而導(dǎo)致癌細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜屏障，向臨近纖維結(jié)締組織浸潤(rùn)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移上發(fā)揮重要功能。
　　RNAi是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法，因其作用機(jī)制為細(xì)胞內(nèi)通過(guò)mRNA特異基因序列降解而使目的基因沉默(gene silencing)，故具有極高的靶向性和有效性。目前RNAi技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、基因功能鑒定等熱門(mén)研

5、究領(lǐng)域，并在許多疾病的基因治療上顯示了巨大的應(yīng)用前景。
　　目的:第一部分，通過(guò)分別檢測(cè)VEGF-A、VEGF-C和MMP-2在膽管癌組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，分析VEGF-A、VEGF-C和MMP-2表達(dá)與膽管癌臨床病理因素、臨床預(yù)后的相關(guān)性。進(jìn)一步檢測(cè)膽管癌組織標(biāo)本中微血管密度（MVD）和微淋巴管密度(MLVD)，以此來(lái)說(shuō)明VEGF-A、VEGF-C和MMP-2蛋白表達(dá)在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中所起到的作用。第二部分，通

6、過(guò)RNAi技術(shù)構(gòu)建特異性VEGF-siRNA表達(dá)載體抑制膽管癌細(xì)胞中VEGF基因的表達(dá)，并從中篩選出干擾效率最高的小RNA干擾表達(dá)質(zhì)粒。第三部分，通過(guò)VEGF-siRNA表達(dá)載體下調(diào)QBC939膽管癌細(xì)胞中VEGF-A、VEGF-C和MMP-2基因的表達(dá)，從細(xì)胞水平探討三者在膽管癌發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)47例膽管癌組織、40例鄰近非癌膽管組織及15例正常膽管組織中VEGF

7、-A、VEGF-C和MMP-2蛋白的表達(dá)情況，分析膽管癌組織中VEGF-A、VEGF-C和MMP-2的表達(dá)與膽管癌臨床病理因素及患者預(yù)后之間的關(guān)系。
　　2.用CD105和D2-40分別對(duì)47例膽管癌組織、40例鄰近非癌膽管組織及15例正常膽管組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，并采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)其中CD105和D2-40蛋白的表達(dá)情況。顯微鏡下分別對(duì)47例膽管癌組織、40例鄰近非癌膽管組織及15例正常膽管組織的M

8、VD和MLVD進(jìn)行計(jì)數(shù)，以此分析MVD和MLVD與VEGF-A、VEGF-C及MMP-2間的相互關(guān)系，進(jìn)一步說(shuō)明VEGF-A、VEGF-C和MMP-2蛋白表達(dá)在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中所起到的作用。
　　3.構(gòu)建特異性VEGF-siRNA表達(dá)載體，使用脂質(zhì)體載體將其分別轉(zhuǎn)染至膽管癌細(xì)胞系QBC939、HCCC-9810和RBE中，篩選出針對(duì)VEGF基因抑制效率最高的VEGF-siRNA序列。
　　4.通過(guò)RT-PC

9、R和Western blotting法分別檢測(cè)VEGF-siRNA轉(zhuǎn)染后膽管癌QBC939細(xì)胞中VEGF-A、VEGF-C及MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　5.分別采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、MMT法和流式細(xì)胞分析技術(shù)(FCM)檢測(cè)VEGF-siRNA轉(zhuǎn)染后膽管癌QBC939細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和增殖的能力及腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況。
　　結(jié)果:
　　1.與鄰近非癌膽管組織和正常膽管組織相比，VEGF-A、VEG

10、F-C及MMP-2蛋白在膽管癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯增多。VEGF-A、VEGF-C蛋白高表達(dá)與膽管癌浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而MMP-2蛋白高表達(dá)膽管癌浸潤(rùn)深度、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。對(duì)膽管癌組織中VEGF-A，VEGF-C和MMP-2的進(jìn)行兩兩比較，其蛋白表達(dá)均為正相關(guān)。Cox多因素分析結(jié)果發(fā)VEGF-A、VEGF-C和MMP-2的蛋白表達(dá)水平均是影響膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。
　　2.膽管

11、癌組織中MVD顯著高于鄰近非癌膽管組織及正常膽管組織，而膽管癌組織和鄰近非癌膽管組織中MLVD均顯著高于正常膽管組織。MVD和MLVD計(jì)數(shù)水平的高低與膽管癌浸潤(rùn)深度、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。VEGF-A和MMP-2的表達(dá)與MVD水平呈正相關(guān)，三者可作為反映膽管癌微血管生成狀況的指標(biāo);VEGF-C和MMP-2的表達(dá)與MLVD水平呈正相關(guān)，三者可作為反映膽管癌微淋巴管生成狀況的指標(biāo)。
　　3.成功構(gòu)建了VEGF-si

12、RNA表達(dá)載體并能高效的轉(zhuǎn)染進(jìn)膽管癌細(xì)胞系QBC939、HCCC-9810和RBE內(nèi)。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，VEGF-siRNA表達(dá)載體能有效地抑制VEGF mRNA及蛋白在膽管癌細(xì)胞系QBC939、HCCC-9810和RBE中的表達(dá)。其中抑制效率最高的VEGF-siRNA-1干擾片段對(duì)VEGF基因mRNA和蛋白表達(dá)的抑制率分別達(dá)到86.37％和79.72％。
　　4.當(dāng)膽管癌QBC939細(xì)胞系中的VEGF基因被沉默后，其

13、VEGF-A、VEGF-C及MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平較之空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組也明顯下調(diào)，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，使腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移的能力明顯減弱。
　　結(jié)論:
　　1.VEGF-A、VEGF-C及MMP-2在膽管癌組織中呈高表達(dá)，并在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起協(xié)同作用。
　　2.VEGF-A、VEGF-C及MMP-2的高表達(dá)，與膽管癌浸潤(rùn)深度、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等生

14、物學(xué)行為關(guān)系密切。
　　3.VEGF-A、VEGF-C及MMP-2參與調(diào)控膽管癌中微血管密度和微淋巴管密度的水平，并與之水平呈正相關(guān)，提示其在膽管癌新生血管和淋巴管形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　4.VEGF-siRNA表達(dá)載體能特異性抑制膽管癌細(xì)胞系QBC939、HCCC-9810和RBE中VEGF基因，并下調(diào)其mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　5.當(dāng)膽管癌QBC939細(xì)胞系中的VEGF基因被沉默后，其VEGF-A、VE

15、GF-C及MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平也同時(shí)下調(diào)。
　　6.VEGF-siRNA表達(dá)載體可抑制膽管癌QBC939細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其細(xì)胞的凋亡，并降低其細(xì)胞遷移和侵襲的能力。提示通過(guò)VEGF-siRNA治療膽管癌在理論上是可行的。
　　7.VEGF-A、VEGF-C及MMP-2蛋白和mRNA的表達(dá)水平，與膽管癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)，聯(lián)合測(cè)定這三者和CD105、D2-40的表達(dá)水平可能成為評(píng)價(jià)預(yù)后，判斷復(fù)發(fā)的重要而有