VEGF-C和-D在鼻咽癌中的表達(dá)及阻斷VEGF-C作用對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種惡性程度較高的頭頸部惡性腫瘤，在歐洲、北美洲、大洋洲和拉丁美洲等西方國(guó)家較少見，在我國(guó)則是最常見的惡性腫瘤之一。全世界約80％鼻咽癌發(fā)生在我國(guó)，尤以廣東省珠江三角洲流域最常見，所以鼻咽癌也被稱為“廣東瘤”(Canton Tumor)。鼻咽癌對(duì)放療很敏感，放射治療是鼻咽癌的主要治療手段。鼻咽癌對(duì)化療也較敏感，目前鼻咽癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期經(jīng)過(guò)綜合治療的五年生存率分別是95

2、％、80％、62％、40％。但鼻咽癌病人就診時(shí)大部分(約70％)為中晚期，中晚期鼻咽癌有較高的局部復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，嚴(yán)重影響了鼻咽癌生存率的提高。鼻咽癌的轉(zhuǎn)移途徑包括局部浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移。其中頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是鼻咽癌最主要的轉(zhuǎn)移途徑和部位，發(fā)生率可高達(dá)78.9％，而且轉(zhuǎn)移出現(xiàn)早，與預(yù)后密切相關(guān)。如何提高鼻咽癌的局控率、減少轉(zhuǎn)移，是目前鼻咽癌研究的主要任務(wù)之一。 轉(zhuǎn)移是所有惡性腫瘤最主要的行為特征，也是導(dǎo)致腫瘤治療失敗、患者

3、死亡的主要原因之一。如何控制腫瘤轉(zhuǎn)移是目前腫瘤治療中的難題之一。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑是淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移，腫瘤誘導(dǎo)淋巴管和血管形成、增生是腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的先決條件。自上世紀(jì)70年代開始，腫瘤誘導(dǎo)血管生成對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響已為越來(lái)越多的腫瘤研究者所重視，目前抗腫瘤血管生成治療已成為抗腫瘤研究熱點(diǎn)之一，抗腫瘤血管生成治療(如貝伐單抗Bevacizumab，商品名Avastin，一種重組的人源化單克隆IgG1抗體，是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抑制劑

4、)已進(jìn)入臨床并取得了良好的治療效果。而腫瘤轉(zhuǎn)移的另一重要方式——淋巴轉(zhuǎn)移，研究相對(duì)落后。而臨床病理學(xué)研究證實(shí)：大多數(shù)上皮起源的實(shí)體瘤以淋巴道轉(zhuǎn)移為主，最早發(fā)生的是區(qū)域淋巴結(jié)播散，而播散的最早途徑是淋巴管通道。因此目前對(duì)腫瘤淋巴道擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移機(jī)制的基礎(chǔ)和臨床研究對(duì)于攻克惡性腫瘤更具重要性和迫切性。近幾年國(guó)外研究表明：淋巴管生成是受血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族的成員血管

5、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF—C)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D(vascular endothelial growth factor D，VEGF—D)控制，這些生長(zhǎng)因子分泌激活后主要與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3(vascular endothelial growth factot receptor 3，VEGFR-3，即Flt-4)結(jié)合，可促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和淋巴管增生，促

6、進(jìn)腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移，而直接針對(duì)VEGF-C/VEGF—D或其受體VEGFR-3的腫瘤淋巴管生成抑制劑，可能對(duì)人類腫瘤的抗淋巴道轉(zhuǎn)移治療有益。但目前此領(lǐng)域的研究相對(duì)較少。 基于以上研究現(xiàn)狀，本課題擬從臨床病理標(biāo)本和細(xì)胞分子生物學(xué)水平兩個(gè)部分，研究鼻咽癌中VEGF-C和-D的表達(dá)情況及其與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)期生存等腫瘤生物學(xué)特征的關(guān)系，并初步探討VEGF-C在鼻咽癌淋巴管生成中的調(diào)控機(jī)制，試圖為探尋新的抗鼻咽癌淋巴轉(zhuǎn)移的治療手段提供思

7、路。 1.背景及目的VEGF—C和VEGF—D是目前已鑒定出的淋巴管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，一些研究表明腫瘤組織中VEGF—C或VEGF-D過(guò)表達(dá)和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究旨在探討鼻咽癌中VEGF-C和VEGF-D的表達(dá)情況及其臨床意義。 2.方法 采用SP法免疫組化染色技術(shù)檢測(cè)66例鼻咽癌組織中VEGF-C和VEGF-D的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)VEGFR-3和CD34染色情況并計(jì)數(shù)微淋巴管密度(lymphatic microve

8、ssel density ，MVD)和微血管密度(microvessel density，MVD)。 3.結(jié)果 VEGF—C陽(yáng)性高表達(dá)率在鼻咽癌組織中(54.5％)較鼻咽非腫瘤組織中(26.3％)高(P<0.05)；鼻咽癌中VEGF-C高表達(dá)者較低表達(dá)者區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率增高(62.0％：38.096)、T分期也相對(duì)增高，單因素及多因素Logistic回歸分析均表明區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與VEGF-C高表達(dá)相關(guān)(P<0.05)，但

9、VEGF-C高表達(dá)與性別、年齡、5年生存、LMVD、MVD等因素?zé)o關(guān)(P>0.05)。VEGF-D陽(yáng)性表達(dá)率在鼻咽癌組織中(69.7％)較鼻咽非腫瘤組織中(42.1％)高(P<0.05)；鼻咽癌中VEGF-D陽(yáng)性表達(dá)與性別、年齡、T分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LMVD、MVD等因素?zé)o關(guān)(P>0.05)，但與VEGF-C高表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，VEGF-D陽(yáng)性表達(dá)者5年生存率(50.0％)顯著低于VEGF—D不表達(dá)者(85.0％)(

10、P<0.01)。 4.結(jié)論 鼻咽癌中VEGF-C陽(yáng)性高表達(dá)與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；VEGF-D陽(yáng)性表達(dá)與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，但與VEGF-C陽(yáng)性高表達(dá)呈正相關(guān)，且與5年生存率密切相關(guān)。 1.背景與目的VEGF—C通過(guò)與受體VEGFR-3結(jié)合，可促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和淋巴管增生，促進(jìn)腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移。本研究旨在檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株中VEGF-C表達(dá)情況，并探討體外阻斷VEGF-C作用對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞增殖

11、的影響。 2.方法 2.1.采用定性RT—PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR檢測(cè)三株常見人鼻咽癌細(xì)胞株中VEGF-C的表達(dá)情況。 2.2.取人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(human lymphatic endothelial cell，HLEC)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×103/ml，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100ul。實(shí)驗(yàn)分為5組，細(xì)胞生長(zhǎng)24小時(shí)后，每孔加入各種試劑100u1。第①組：HLEC．VS．HLEC+抗VEGFR-3抗體；

12、第②組：HLEC．VS．HLEC+高表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞上清；第⑨組：HLEC+高表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞上清．VS．HLEC+高表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞上清+抗VEGFR-3抗體；第④組：HLEC．VS．HLEC+低表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞上清；第⑤組：HLEC+低表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞上清．VS．HLEC+低表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞上清+抗VEGFR-3抗體。加試劑后24h、48h、72h、96h、12

13、0h觀察各組淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)情況并計(jì)算細(xì)胞數(shù)，比較各組細(xì)胞增殖情況。 2.3.分別收集高表達(dá)VEGF-C的人鼻咽癌細(xì)胞和低表達(dá)VEGF-C的人鼻咽癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為5X104/ml，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種量為1X104個(gè)細(xì)胞，體積為200ul。實(shí)驗(yàn)分為兩組，第①組：高表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞．VS．高表達(dá)VEGF—C的鼻咽癌細(xì)胞+抗VEGFR-3抗體；第②組：低表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞．VS．低表達(dá)VEGF

14、-C的鼻咽癌細(xì)胞+抗VEGFR-3抗體。加試劑后24h、48h、72h、96h、120h用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。 3.結(jié)果 3.1.定性RT—PCR發(fā)現(xiàn)三株常見人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1、CNE2和HNE2均表達(dá)VEGF-C，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)，這三株人鼻咽癌細(xì)胞VEGF-C mRNA差異較大，分別是1.02×106 copy/μg、3.11×104 copy/μg和8.31×104 copy/μg。

15、 3.2.加入抗VEGFR-3抗體的HLEC和未用抗VEGFR-3抗體處理的HLEC增殖速度無(wú)明顯差異(P=0.625)；加入高表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞上清后，HLEC增殖速度明顯加快(P=0.031)；加入高表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞上清的同時(shí)加入抗VEGFR-3抗體，HLEC的增殖速度較僅加入高表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞上清的HLEC的明顯減慢(P=0.038)；加入低表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞上清后，HLEC的增殖速度

16、也加快，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.054)；加入低表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞上清的同時(shí)加入抗VEGFR-3抗體，HLEC的增殖速度較僅加入低表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞上清的HLEC的也有所減慢，但也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.062)。 3.3.向高表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入抗VEGFR-3抗體，鼻咽癌細(xì)胞增殖速度明顯減慢(P=0.019)；向低表達(dá)VEGF-C的鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入抗VEGFR-3抗體，鼻咽癌細(xì)

17、胞的增殖速度稍減慢，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.080)。 4.結(jié)論 4.1.三株常見的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1、CNE2和HNE2均表達(dá)VEGF-C，但差異較大。 4.2.鼻咽癌細(xì)胞分泌VEGF-C對(duì)HLEC有促增殖作用，阻斷VEGF-C作用可以阻斷其對(duì)HLEC的促增殖作用。但低于一定濃度閾值的VEGF-C對(duì)HLEC促增殖作用不明顯，這種情況下阻斷VEGF-C作用對(duì)HLEC增殖影響不大。 4.3.阻斷鼻咽癌